Impacto da infecção crônica pelo Toxoplasma gondii sobre o duodeno e jejuno de camundongos fêmeas C57BL/6

Abstract

RESUMO: A toxoplasmose é uma doença parasitária causada pelo Toxoplasma gondii (T. gondii). A principal forma de aquisição do parasito é pela ingestão de água e alimentos contaminados. Desta forma, o parasito pode desencadear alterações locais no trato gastrointestinal (TGI) ou disseminar-se para outros órgãos e permanecer em seu hospedeiro. Estudos prévios já investigaram os efeitos da aquisição de diferentes inóculos de T. gondii em vários modelos experimentais. Entretanto, trabalhos avaliando os impactos da fase crônica da infecção desencadeada por oocistos em camundongos, ainda não estão caracterizados. Camundongos C57BL/6 são mais sensíveis à infecção e são bastante utilizados para mimetizar a resposta de hospedeiros imunocomprometidos. Assim, este trabalho objetivou analisar a histoarquitetura intestinal do duodeno e jejuno de camundongos C57BL/6 frente à infecção crônica causada pelo T. gondii. O experimento foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UEM (protocolo 4092040517). Para o estudo foram utilizados 16 camundongos C57BL/6 fêmeas, provenientes do Biotério do Laboratório de Inflamação, da Universidade Estadual de Maringá/UEM. Aos 60 dias de vida, os animais foram distribuídos em: grupo controle (GC, n=8), que recebeu solução salina; e grupo infectado (GI, n=8) que recebeu suspensão contendo 1.000 oocistos esporulados do parasito (cepa ME-49, genótipo II) por gavagem. Após 60 dias de infecção os animais foram submetidos à eutanásia, o duodeno e o jejuno foram dissecados, colocados em fixador paraformaldeído 4% tamponado ou congelados em nitrogênio líquido e distribuídos nas diferentes técnicas. Para análise histológica, as amostras foram processadas histologicamente, e realizados cortes seriados com 5µm de espessura, corados pelas técnicas de hematoxilina e eosina (H.E.) para análise da morfologia e morfometria de parede intestinal, células de Paneth e contagem dos linfócitos intraepiteliais (LIE). Cortes corados com ácido periódico de Schiff (PAS), Alcian-Blue com pH 2,5 (AB2,5) e 1,0 (AB1,0) foram utilizados para quantificação das células caliciformes produtoras de mucinas neutras, sialomucinas e sulfomucinas respectivamente. Cortes corados com azul de toluidina foram utilizados para quantificação de mastócitos. A área ocupada pelas fibras colágenas totais, tipo I e tipo III presentes na matriz extracelular foi mensurada em cortes corados com picrosírius red e contra-corados por hematoxilina de Harris. Fragmentos de duodeno e jejuno congelados em nitrogênio líquido foram utilizados para dosagens das enzimas mieloperoxidade (MPO), N-acetil- ?-D-glucosaminidase (NAG) e quantificação indireta de óxido nítrico (NO). Também foi realizada imunohistoquímica em preparados totais para quantificação da população neuronal total (?-tubulina III) e população glial total (S100) do plexo mientérico do jejuno. A infecção crônica de camundongos C57BL/6 com oocistos de T. gondii (ME-49) não alterou o ganho de peso dos animais nem a morfologia geral do intestino delgado. Foi observado processo inflamatório brando evidenciado pelo aumento no número de LIE e de mastócitos. No epitélio do duodeno houve aumento de células caliciformes AB2,5-positivas e redução das PAS-positivas. O jejuno apresentou vilos mais altos nos animais infectados. Na análise da matriz extracelular houve aumento na área ocupada pelas fibras colágenas do tipo III no duodeno. Houve aumento significativo de NO no jejuno do GI em comparação ao GC. No estudo do SNE, observou-se que a fase crônica da infecção alterou a população de CGE no jejuno infectado, que aumentou significativamente. Em conclusão, nossos resultados demonstram que a infecção crônica por oocistos de T gondii (ME-49) provocou alterações no TGI de camundongos fêmeas C57BL/6. Este trabalho evidencia que mesmo após 60 dias de infecção, ainda há uma resposta branda do organismo na tentativa de conter as reações causadas pelo parasito afim de recobrar a homeostase intestinal. A persistência deste estímulo inflamatório poderia contribuir com os quadros de doença inflamatória intestinal, cada vez mais frequentes na população humana.

ABSTRACT: Toxoplasmosis is a disease caused by the parasite Toxoplasma gondii. It is transmitted mainly orally. Once ingested, the parasite can trigger local changes in the gastrointestinal tract (GIT). Previous studies have already investigated the effects of acute and chronic infection triggered by T. gondii in several experimental models. However, chronic infection in mice has not been characterized. In this sense, we intend to analyze the impacts of chronic infection triggered by T. gondii oocysts on the myoenteric plexus of the jejunum, as well as on the duodenum / jejunum wall of C57BL / 6 mice. This experimental protocol was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of State University of Maringá (protocol 4092040517). Sixteen C57BL / 6 mice hardened at 60 days of age were divided into two groups: a control group (CG, n = 8) and an infected group (IG, n = 8). While the GC specialty saline solution, GI mice were inoculated orally with 1,000 sporulated oocysts of the parasite (strain ME-49, genotype II) by gavage. A histological analysis of the mucosa, submucosa, villi and crypts was performed. Goblet cells, mast cells, intraepithelial lymphocytes (IELs) and Paneth cells were quantified. The area occupied by total collagen fibers, type I and type III present in the extracellular matrix was measured. Frozen fragments of duodenum and jejunum were used to quantify myeloperoxity (MPO), N-acetyl-?-D-glucosaminidase (NAG) and nitric oxide (NO). Immunohistochemistry was used to determine total myenteric neurons (?-tubulin III) and glial cells (S100) in the jejunum. As main results, it was observed that an infection caused an increase in mast cells, IELs, goblet cells AB 2.5+, regarding NO. However, decreased number of goblet cells PAS + and type III collagen fibers. There were no differences between groups regarding the number of goblet cells AB 1.0, MPO and NAG activity, total and type I collagen fibers, total neurons and intestinal wall morphometry. The villi of the jejunum were higher in the IG compared to the CG. In summary, chronic T. gondii infection in mice caused morphological changes in the intestinal wall, altered distribution of epithelial cells in the mucosa of the duodenum and jejunum, leading to quantitative changes in the glial cells of the jejunal myoenteric plexus. The persistence of the inflammatory stimulus contributed to inflammatory bowel disease, which is increasingly common in the human population.