Mecanismos de respostas e potencial biotecnológico de bactérias isoladas de água utilizada na lavagem de embalagens de agrotóxicos

Abstract

RESUMO: Esta Tese é composta por três capítulos que possuem uma base conceitual comum, a serem submetidos como artigos independentes. No capítulo I, discutimos como os tanques de armazenamento de água contaminada com agrotóxicos se constituem em um modelo de ecossistema artificial, no qual espécies não-alvo, particularmente microrganismos, precisam de vários mecanismos de resposta para sobreviverem. Esses conceitos são expandidos para outros ecossistemas contaminados. Devido às condições estressantes presentes nesses ambientes, eles são considerados hotspots para a seleção de chassis bacterianos, ou consórcios de linhagens que possuem combinações de genes que codificam diversos fenótipos adaptados para sobrevivência contra uma gama de substâncias tóxicas, e que poderão ser aproveitados em aplicações biotecnológicas. No capítulo II, discutimos como a competição por recursos em ambientes limitantes seleciona microrganismos, produzindo metabólitos secundários, por exemplo, que favorecem o seu desenvolvimento, e podem ser utilizados em estratégias de biocontrole de fungos como Sclerotinia sclerotiorum, um fungo fitopatogênico que causa perdas econômicas substanciais nas lavouras. Neste capítulo foi estudada a bactéria Bacillus velezensis CMA9, que permaneceu por seis anos em tanques de armazenamento de água contaminados com agrotóxicos. A análise do genoma revelou a presença de sete clusters de genes biossintéticos para os metabólitos secundários bacilisina, bacilibactina, macrolactina H, bacileno, fengicina, estafiloferrina A e termoactinoamida A. Esses metabólitos podem estar associados à capacidade competitiva de B. velezensis CMA9 e sobrevivência da linhagem no ambiente de isolamento. A linhagem foi capaz de inibir o crescimento micelial de S. sclerotiorum e da germinação do escleródio in vitro, tanto por confronto direto quanto pela exposição ao sobrenadante livre de células. No capítulo III, discutimos um sistema de resposta relativamente pouco explorado e possivelmente utilizado para sobrevivência em seis anos em água contaminada com agrotóxicos e com poucos nutrientes: a bacteriostase, caracterizada por um estado fisiológico sem crescimento celular, mas metabolicamente ativo. Pluralibacter gergoviae CMA6 apresentou a bacteriostase para tolerar concentrações elevadas do glifosato isoladamente, e em conjunto com ciprofloxacina (CIP), substâncias ausentes no tanque, observada pela retomada de crescimento após a retirada destes agentes seletivos. Análises genômicas revelaram a presença de genes envolvidos na tolerância à metais pesados, peróxido de hidrogênio e a síntese do sideróforo enterobactina, provavelmente relacionados a sobrevivência em ambientes contaminados. Apesar de terem sido encontrados genes de resistência a fluoroquinolonas, os sistemas que esses genes compõem estavam incompletos no genoma, indicando a sensibilidade à CIP. Características de bacteriostase foram determinadas pelas análises de expressão gênica, como a atividade metabólica nesta fase, indicada pela atividade de gyrA, associado à transcrição e o controle dos indicadores de estresse oxidativo. A ausência de crescimento foi associada a bacteriostase, e não à persistência e dormência, uma vez que houve redução da expressão de genes associados a estas características, dam e hspA, respectivamente. A recuperação do crescimento pós bacteriostase pode ter ocorrido devido ao acúmulo de fosfoenolpiruvato, determinada pela expressão do gene ppsA. As características analisadas provavelmente foram relacionadas a sobrevivência desta bactéria em seu ambiente de origem, e podem ser utilizadas em biotecnologia industrial em processos relacionados a conversão de matéria-prima em um produto desejado, independentemente de biomassa, utilizando processos de edição gênica

ABSTRACT: This Thesis consists of three chapters that share a common conceptual basis and are to be submitted as independent articles. In Chapter I, we discuss how tanks storing water contaminated with pesticides constitute a model artificial ecosystem in which non-target species, particularly microorganisms, require various response mechanisms to survive. These concepts are expanded to other contaminated ecosystems. Due to the stressful conditions present in these environments, they are considered hotspots for the selection of bacterial chassis, or consortia of strains with combinations of genes encoding diverse phenotypes adapted for survival against a range of toxic substances, which could be harnessed in biotechnological applications. In Chapter II, we discuss how competition for resources in limiting environments selects microorganisms, producing secondary metabolites, for example, that favor their development and can be used in biocontrol strategies for fungi such as Sclerotinia sclerotiorum, a phytopathogenic fungus that causes substantial economic losses in crops. This chapter studied the bacterium Bacillus velezensis CMA9, which remained for six years in water storage tanks contaminated with pesticides. Genome analysis revealed the presence of seven biosynthetic gene clusters for the secondary metabolites bacillysin, bacilibactin, macrolactin H, bacillen, fengycin, staphyloferrin A, and thermoactinamide A. These metabolites may be associated with the competitive capacity of B. velezensis CMA9 and the survival of the strain in the isolation environment. The strain was able to inhibit the mycelial growth of S. sclerotiorum and sclerotia germination in vitro, both by direct confrontation and by exposure to cell-free supernatant. In Chapter III, we discussed a relatively little-explored response system that may be used for six-year survival in pesticide-contaminated water with few nutrients: bacteriostasis, characterized by a physiological state without cell growth but metabolically active. Pluralibacter gergoviae CMA6 exhibited bacteriostasis to tolerate high concentrations of glyphosate alone and in combination with ciprofloxacin (CIP), substances absent in the tank, as demonstrated by the resumption of growth after the removal of these selective agents. Genomic analyses revealed the presence of genes involved in tolerance to heavy metals, hydrogen peroxide, and the synthesis of the siderophore enterobactin, likely related to survival in contaminated environments. Although fluoroquinolone resistance genes were found, the systems comprising these genes were incomplete in the genome, indicating sensitivity to CIP. Characteristics of bacteriostasis were determined by gene expression analyses, such as metabolic activity in this phase, indicated by gyrA activity, associated with transcription, and the control of oxidative stress indicators. The absence of growth was associated with bacteriostasis, not persistence or dormancy, since there was reduced expression of genes associated with these characteristics: dam and hspA, respectively. Growth recovery after bacteriostasis may have occurred due to the accumulation of phosphoenolpyruvate, determined by the expression of the ppsA gene. The analyzed characteristics were likely related to the survival of this bacterium in its native environment and can be used in industrial biotechnology in processes related to the conversion of raw materials into a desired product, regardless of biomass, using gene editing processes