Extrato do bagaço de Citrus sinensis no controle de Meloidogyne javanica em soja

Abstract

RESUMO: Resíduos provenientes da indústria de sucos cítricos, em especial da laranja (Citrus sinensis), além da disponibilidade em larga escala, possuem significativo potencial de aproveitamento na proteção das culturas contra fitonematoides, devido à rica composição fitoquímica do bagaço, ainda pouco explorado. Visto os crescentes prejuízos resultantes da infecção de nematoides, em especial Meloidogyne javanica, é imprescindível a busca de tecnologias alternativas que associem eficiência e sustentabilidade para serem exploradas no sistema de manejo, contudo, é essencial que novas estratégias resultem em interações benéficas com a microbiota do solo e agentes de controle biológico. Assim, no primeiro capítulo, objetivou-se determinar a composição química do extrato metanólico do bagaço de C. sinensis e suas frações, investigar os efeitos na eclosão de juvenis de segundo estádio (J2) de M. javanica in vitro e, na reprodução dos nematoides em soja, em duas formas de aplicação. Para isso, o extrato metanólico bruto (EMB) foi particionado nas frações hexano (FHX), diclorometano (FDCM), acetato de etila (FAE) e hidrometanol (FHM). A caracterização química do EMB, FDCM, FAE e FHM foi realizada por desreplicação em espectrometria de massa de alta resolução. No ensaio de eclosão, bagaço fresco, bagaço seco, EMB, FHX, FDCM e FAE e FHM foram testados nas diluições 0 (água), 0,5%, 1,0% e 1,5%. Já para a avaliação da reprodução do nematoide, os mesmos tratamentos foram avaliados a 1,5%. Foram identificados ácidos orgânicos, flavonoides, compostos fenólicos, lipídeos, terpenos, aminoácidos, nucleosídeos e bases nitrogenadas. Todos tratamentos e concentrações reduziram a eclosão de J2 em comparação à testemunha, sendo o bagaço fresco e seco, FHX e FHM os mais eficazes. Todos os tratamentos reduziram a reprodução de M. javanica em soja, com destaque para FDCM e FAE. A aplicação via tratamento de sementes proporcionou controle mais efetivo de M. javanica em relação à aplicação em sulco de semeadura. No segundo capítulo, objetivou-se investigar o efeito de FAE e FDCM na penetração e reprodução de M. javanica em raízes de soja, bem como sua influência nas respostas de defesa das plantas. Para a avaliação da reprodução, foram utilizados os tratamentos: testemunha, FAE, FDCM e FAE+FDCM, na diluição de 1,5%, além dos padrões comerciais abamectina e extrato de Allium sativum. A penetração do nematoide foi avaliada com os tratamentos: testemunha, FAE, FDCM e FAE+FDCM, os quais foram os mesmos para a avaliação da expressão das enzimas de defesa vegetal. Todos os tratamentos reduziram a reprodução de M. javanica em soja, em relação à testemunha, sendo os mais eficientes o padrão químico (78%), seguido por FDCM (51%), FAE+FDCM (50%), FAE (44%) e o extrato de A. sativum (44%). Todas as frações reduziram a penetração e a quantidade final de M. javanica nas raízes de soja, com destaque para FAE, exercendo ainda, efeito nas respostas de defesa das plantas. A fração FAE induziu a atividade precoce da POX, aos 2 e 4 DAI, bem como a CAT, aos 2 e 8 DAI. FDCM aumentou a atividade da PAL aos 10 e 12 DAI. Já FAE e FDCM aumentaram a atividade da PPO, porém não diferiram da testemunha. Por fim, a associação entre FAE+FDCM promoveu maior atividade da CAT aos 8, 10 e 12 DAI. No terceiro capítulo, objetivou-se avaliar, in vitro, o efeito de FAE e FDCM no crescimento de agentes biológicos utilizados no manejo de nematoides, sua influência no parasitismo de ovos de M. javanica por fungos nematófagos, bem como verificar os efeitos da combinação dessas frações com nematicidas sobre a reprodução de M. javanica em soja. Para a avaliação da reprodução, foram utilizados os padrões de mercado a base de Purpureocillium lilacinum Pochonia chlamydosporia, Bacillus firmus e abamectina, associados à FAE e FDCM, na diluição de 1,5%, além dos controles (sem a associação). Para o ensaio de crescimento microbiano, os microrganismos foram isolados dos produtos comerciais e cultivados em meio de cultura acrescido, ou não, das frações. Para a avaliação do parasitismo de ovos de M. javanica, os fungos foram testados em associação à FAE e FDCM. As frações aplicadas isoladamente foram eficientes na redução da reprodução de M. javanica em soja e ainda, a associação com nematicidas não influenciou o controle do nematoide. As frações reduziram o crescimento micelial e a esporulação de P. chlamydosporia e P. lilacinum, bem como o número de UFC de B. firmus, em maior intensidade com FAE. A associação de P. chlamydosporia e P. lilacinum com FAE e FDCM reduziu o parasitismo de ovos de M. javanica. Conclui-se que o extrato do bagaço de C. sinensis é rico em compostos bioativos, com efeitos diretos em ovos de M. javanica, inibindo a eclosão de J2, reduzindo a penetração e a reprodução dos nematoides em soja, bem como induzindo a expressão de enzimas relacionadas à defesa vegetal. As frações FAE e FDCM possuem efeito nocivo ao crescimento e esporulação de P. chlamydosporia e P. lilacinum, bem como à viabilidade de B. firmus, contudo, em associação aos nematicidas, não influenciam o potencial de controle de M. javanica

ABSTRACT: Citrus juice industry residues, particularly from orange (Citrus sinensis), are not only widely available but also hold significant potential for crop protection against plant- parasitic nematodes due to the rich phytochemical composition of the pomace, which remains underexplored. Given the increasing losses caused by nematode infections, especially Meloidogyne javanica, the search for alternative technologies that combine efficiency and sustainability is essential for integration into management systems. However, it is critical that new strategies also promote beneficial interactions with soil microbiota and biological control agents. In the first chapter, the objective was to determine the chemical composition of the methanolic extract of C. sinensis pomace and its fractions, to investigate their effects on the in vitro hatching of second-stage juveniles (J2) of M. javanica, and on nematode reproduction in soybean under two application methods. The crude methanolic extract (CME) was partitioned into hexane (HXF), dichloromethane (DCMF), ethyl acetate (EAF), and hydromethanol (HMF) fractions. Chemical characterization of CME, DCMF, EAF, and HMF was performed by dereplication using high-resolution mass spectrometry. In the hatching assay, fresh pomace, dry pomace, CME, HXF, DCMF, EAF, and HMF were tested at dilutions of 0 (water), 0.5%, 1.0%, and 1.5%. For nematode reproduction, the same treatments were evaluated at 1.5%. Organic acids, flavonoids, phenolic compounds, lipids, terpenes, amino acids, nucleosides, and nitrogenous bases were identified. All treatments and concentrations reduced J2 hatching compared with the control, with fresh and dry pomace, HXF, and HMF being the most effective. All treatments reduced M. javanica reproduction in soybean, with the greatest effects observed for DCMF and EAF. Seed treatment provided more effective control of M. javanica than furrow application. In the second chapter, the objective was to investigate the effects of EAF and DCMF on the penetration and reproduction of M. javanica in soybean roots, as well as their influence on plant defense responses. For reproduction assays, the treatments consisted of control, EAF, DCMF, and EAF+DCMF (all at 1.5%), along with the commercial standards abamectin and Allium sativum extract. Nematode penetration was evaluated under the treatments control, EAF, DCMF, and EAF+DCMF, which were also applied for the assessment of defense-related enzyme expression. All treatments reduced M. javanica reproduction in soybean compared with the control, with the most effective being the chemical standard (78%), followed by DCMF (51%), EAF+DCMF (50%), EAF (44%), and A. sativum extract (44%). All fractions reduced nematode penetration and final population in soybean roots, with EAF showing the strongest effects, also influencing plant defense responses. EAF induced early peroxidase (POX) activity at 2 and 4 days after inoculation (DAI), as well as catalase (CAT) activity at 2 and 8 DAI. DCMF increased phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activity at 10 and 12 DAI. Both EAF and DCMF increased polyphenol oxidase (PPO) activity, although not differing significantly from the control. The combination EAF+DCMF promoted higher CAT activity at 8, 10, and 12 DAI. In the third chapter, the objective was to evaluate, in vitro, the effects of EAF and DCMF on the growth of biological control agents used in nematode management, their influence on egg parasitism of M. javanica by nematophagous fungi, and to assess the effects of combining these fractions with nematicides on nematode reproduction in soybean. For reproduction assays, the commercial standards based on Purpureocillium lilacinum + Pochonia chlamydosporia, Bacillus firmus, and abamectin were applied in association with EAF and DCMF (1.5%), in addition to their respective controls (without association). For microbial growth assays, the microorganisms were isolated from commercial products and cultivated in media supplemented or not with the fractions. For egg parasitism assays, fungi were tested in association with EAF and DCMF. The fractions Applied individually were effective in reducing M. javanica reproduction in soybean, and their combination with nematicides did not alter nematode control. The fractions reduced mycelial growth and sporulation of P. chlamydosporia and P. lilacinum, as well as CFU counts of B. firmus, with stronger inhibition by EAF. The association of P. chlamydosporia and P. lilacinum with EAF and DCMF decreased egg parasitism of M. javanica. In conclusion, the C. sinensis pomace extract is rich in bioactive compounds with direct effects on M. javanica eggs, inhibiting J2 hatching, reducing nematode penetration and reproduction in soybean, and inducing the expression of defense-related enzymes. The EAF and DCMF fractions exert detrimental effects on the growth and sporulation of P. chlamydosporia and P. lilacinum, as well as on the viability of B. firmus; however, when combined with nematicides, they do not impair the control potential against M. javanica