Expressão do gene BmsbRNA e novas abordagens para o controle da infecção pelo BmNPV em Bombyx mori

Abstract

RESUMO: Bombyx mori (B. mori), conhecido como bicho-da-seda, é um importante organismo modelo de estudo da ordem Lepidoptera. A sericicultura, atividade voltada à criação do bicho-da-seda, enfrenta diversos problemas relacionados a doenças, dentre os quais destaca-se a causada pelo Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), que compromete significativamente a produção sericícola. O vírus induz a liquefação do tegumento de lagartas de B. mori durante o ciclo viral, processo fundamental para a liberação e propagação dos vírions. Uma das principais proteínas envolvidas nessa etapa é a catepsina (V-CATH) e a quitinase (V-CHIA). O gene v-cath codifica a protease V-CATH, proteína envolvida na degradação de tecidos do hospedeiro, favorecendo a progressão da infecção. Diante desse cenário, torna-se fundamental a identificação e o estudo de compostos capazes de inibir esses fatores virais, com potencial para reduzir a progressão da infecção e os impactos da doença na sericicultura. O composto Bm7 demonstrou inibir de forma eficaz a atividade da protease V-CATH, evidenciando seu potencial como agente no controle da infecção viral. Nesse contexto, torna-se relevante investigar os mecanismos mediados por RNAs não codificantes (ncRNAs), os quais desempenham papel importante na resposta imunológica frente à infecção. Entre os ncRNAs, destacam-se os sbRNAs (stem-bulge RNAs), homólogos em estrutura e função aos YRNAs, reconhecidos por sua participação no início do processo de replicação do DNA. Em B. mori, esses ncRNAs foram descritos pela primeira vez em 2015 e denominados BmsbRNAs. No primeiro capítulo, foram realizadas análises da expressão do BmsbRNA em células da linhagem Bm5 de B. mori infectadas pelo BmNPV, na presença ou ausência do composto Bm7. A expressão gênica foi avaliada em 15, 30 e 45 minutos, correspondendo às etapas anteriores à infecção pelo baculovírus BmNPV, tratadas ou não com Bm7, e em amostras controle tratadas com água deionizada. Essa abordagem permitiu investigar os efeitos da infecção viral e do tratamento com Bm7 sobre a dinâmica de expressão do gene BmsbRNA. Nas amostras infectadas, o vírus diminuiu o nível de expressão do gene BmsbRNA, embora os valores não tenham sido estatisticamente significativos em nenhuma das amostras ao longo do tempo. Do mesmo modo, em experimentos com células Bm5 infectadas ou não com BmNPV, o tratamento dessas amostras com o composto Bm7 apresentou níveis de expressão mais elevados do gene BmsbRNA, mas não foram estatisticamente significativos. A avaliação da expressão dos genes virais v-cath e odv-ec27 após uma hora de infecção mostrou aumento na expressão em células tratadas com o composto Bm7, o que sugere que o vírus possa modular esses genes como estratégia compensatória frente à ação inibitória do composto. Além disso, análises in silico indicaram que o BmsbRNA apresenta interação com a proteína viral LEF-2, evidenciada por simulações de docking e dinâmica molecular, sugerindo um possível papel regulatório desse ncRNA na modulação da proteína. No segundo capítulo, foram realizadas análises detalhadas da localização genômica do gene BmsbRNA, bem como uma avaliação global do perfil de expressão gênica em amostras públicas de RNA-seq de lagartas de B. mori infectadas ou não por BmNPV, coletadas após 72 horas de infecção. As análises de localização genômica indicaram que o BmsbRNA está situado em um segmento do éxon 5, no sentido antissenso do gene da Tubulina glicilase 3A (variantes X1, X2 e X3). Adicionalmente, análises globais baseadas em dados públicos de RNA-seq do projeto PRJNA1102047, incluindo volcano plots e heatmaps, permitiram uma avaliação abrangente das mudanças no perfil de expressão gênica decorrentes da infecção por BmNPV. Os resultados indicaram o predomínio de genes associados à resposta imune e à defesa antiviral nas amostras infectadas, enquanto, nas amostras não infectadas, foram observadas principalmente funções relacionadas à manutenção da homeostase celular e às atividades fisiológicas normais. O gene BmsbRNA, com tamanho reduzido de 57 nucleotídeos, não foi detectado nas análises de RNA-seq, provavelmente devido às limitações de detecção associadas a esse tamanho.

ABSTRACT: Bombyx mori (B. mori), known as the silkworm, is an important model organism for studying the order Lepidoptera. Sericulture, the activity of raising silkworms, faces several problems related to diseases, among which the one caused by Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) stands out, significantly compromising sericultural production. The virus induces liquefaction of the integument of B. mori caterpillars during the viral cycle, a process that is essential for the release and propagation of virions. One of the main proteins involved in this stage is cathepsin (V-CATH) and chitinase (V-CHIA). The v-cath gene encodes the V-CATH protease, a protein involved in the degradation of host tissues, favoring the progression of infection. Given this scenario, it is essential to identify and study compounds capable of inhibiting these viral factors, with the potential to reduce the progression of infection and the impacts of the disease on sericulture. The compound Bm7 has been shown to effectively inhibit the activity of the V-CATH protease, demonstrating its potential as an agent in controlling viral infection. In this context, it is relevant to investigate the mechanisms mediated by non-coding RNAs (ncRNAs), which play an important role in the immune response to infection. Among ncRNAs, sbRNAs (stem bulge RNAs) stand out, homologous in structure and function to YRNAs, recognized for their participation in the initiation of the DNA replication process. In B. mori, these ncRNAs were first described in 2015 and named BmsbRNAs. Given this context in the first chapter, analyses of BmsbRNA expression were performed in cells of the Bm5 lineage of B. mori infected with BmNPV, in the presence or absence of the compound Bm7. Gene expression was evaluated at 15, 30, and 45 minutes, corresponding to the stages prior to infection by the baculovirus BmNPV, treated or not treated with Bm7, and control samples treated with deionized water. This approach allowed us to investigate the effects of viral infection and treatment with Bm7 on the expression dynamics of the BmsbRNA gene. In infected samples, the virus decreased the expression level of the BmsbRNA gene, although the values were not statistically significant in any of the samples over time. Similarly, in experiments with Bm5 cells that were infected or not infected with BmNPV, treatment of these samples with the Bm7 compound resulted in higher expression levels of the BmsbRNA gene, but these were not statistically significant. The evaluation of the expression of the viral genes v-cath and odv-ec27 after one hour of infection showed an increase in expression in cells treated with the Bm7 compound, suggesting that the virus may modulate these genes as a compensatory strategy against the inhibitory action of the compound. In addition, in silico analyses indicated that BmsbRNA interacts with the viral protein LEF-2, as evidenced by docking and molecular dynamics simulations, suggesting a possible regulatory role for this ncRNA in protein modulation. In the second chapter, detailed analyses of the genomic location of the BmsbRNA gene were performed, as well as a global evaluation of the gene expression profile in public RNA-seq samples from B. mori caterpillars infected or not infected with BmNPV, collected 72 hours after infection. Genomic localization analyses indicated that BmsbRNA is located in a segment of exon 5, in the antisense direction of the Tubulin glycylase 3A gene (variants X1, X2, and X3). Additionally, global analyses based on public RNA-seq data from the PRJNA1102047 project, including volcano plots and heatmaps, allowed for a comprehensive assessment of changes in gene expression profiles resulting from BmNPV infection. The results indicated the predominance of genes associated with immune response and antiviral defense in infected samples, while in uninfected samples, functions related to the maintenance of cellular homeostasis and normal physiological activities were mainly observed. The BmsbRNA gene, with a reduced size of 57 nucleotides, was not detected in RNA-seq analyses, probably due to detection limitations associated with this size.