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Authors: Castro, Lorena dos Santos
Orientador: Adelar Bracht
Title: Contribuições para o conhecimento dos efeitos do BHT e outros antioxidantes no fígado
Banca: Ana Carla Broetto Biazon
Banca: Cristiane Vizioli de Castro Ghizoni
Keywords: Metabolismo hepático;Ensaios enzimáticos;Análises antioxidantes;Hidroxitolueno butilado;Antioxidantes;Brasil.;Antioxidants;Butylated hydroxytoluene;Liver metabolism;Brazil.
Issue Date: 2017
Publisher: Universidade Estadual de Maringá
Resumo: O hidroxitolueno butilado (BHT) é amplamente utilizado como antioxidante pela indústria alimentícia, cosmética, farmacêutica e em produtos derivados do petróleo. É também comercializado em cápsulas como suplemento alimentar para a saúde. Como antioxidante, inibe a peroxidação lipídica, efeito que também pode exercer em sistemas biológicos. Sabe-se que a ingestão de substâncias capazes de eliminar radicais livres (antioxidantes) pode, pelo menos em parte, evitar os efeitos deletérios das espécies reativas de oxigênio (ROS). A geração dessas espécies nas mitocôndrias é muito importante, podendo contribuir significativamente para danos em organelas e em várias patologias. Sendo assim, bons eliminadores de radicais livres devem estar ativos na menor concentração possível, permitindo a ingestão de doses mais baixas possíveis. A capacidade dos antioxidantes na eliminação dos radicais livres é geralmente avaliada utilizando ensaios químicos, como os métodos baseados na neutralização dos radicais gerados pelos compostos 1,1-difenil-2-picril-hidrazila (DPPH) e ácido 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico (ABTS). Não existe garantia de que uma determinada substância ativa na eliminação de radicais livres num sistema artificial também seja capaz de eliminar com a mesma eficiência as espécies reativas de oxigênio produzidas pelas mitocôndrias. Em adição aos seus efeitos como antioxidante, potenciais efeitos adversos associados ao uso do BHT já foram relatados. Por exemplo, existem relatos de que o BHT é capaz solubilizar membranas lisossomais e desorganizar a estrutura das mitocôndrias, o que pode sugerir que este composto interfere com o metabolismo celular. De fato, estudos demonstram que o BHT interfere com o funcionamento mitocondrial por dois mecanismos distintos: desacoplamento entre o transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa e inibição do complexo I da cadeia transportadora de elétrons. Estes dados sugerem, em teoria, que o BHT deve estimular ou inibir a captação de oxigênio, estimular as vias catabólicas e inibir as vias anabólicas. Tais ações além de outras, têm sido claramente demonstradas com vários desacopladores e inibidores respiratórios. Com base no exposto, o presente trabalho possui dois objetivos distintos: 1) realizar um estudo sistemático dos efeitos metabólicos do BHT no fígado de rato, utilizando o fígado em perfusão isolada e também mitocôndrias isoladas e 2) comparar a atividade sequestradora de radicais livres do BHT e de vários outros antioxidantes bem conhecidos em sistemas químicos com aquela exercida em mitocôndrias isoladas. Em relação a este último aspecto, este estudo deverá informar sobre o real potencial antioxidante do BHT e de diversos outros antioxidantes num sistema biológico (geração de ROS em mitocôndrias). Nos experimentos foram utilizados ratos machos Wistar, pesando 200- 280g. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes éticas aceitas mundialmente para experimentação em animais e foram previamente aprovadas pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Maringá (protocolo nº 9120290915). Para os experimentos de perfusão do fígado isolado de rato, foi utilizado um sistema de perfusão não-recirculante, livre de hemoglobina (tampão Krebs/Henseleit- bicarbonato, pH 7,4, saturado com O2:CO2 na proporção 95:5). Ratos em jejum de 18 horas foram utilizados. O BHT foi dissolvido no líquido de perfusão e infundido em concentrações de 1 a 500 μM. Lactato e frutose foram utilizados como substratos neoglicogênicos e, a partir das amostras do perfusado, foram feitos ensaios enzimáticos para determinação da concentração de glicose, lactato e piruvato. O consumo de oxigênio foi monitorado continuamente por um eletrodo de platina. Dois ensaios distintos foram realizados para avaliar os efeitos do BHT sobre a atividade respiratória de mitocôndrias. Os primeiros ensaios foram aqueles clássicos utilizando mitocôndrias intactas e fosforilantes, onde a velocidade do consumo de oxigênio na ausência (estado IV) ou presença (estado III) de ADP foi avaliada, assim como o controle respiratório (RC). Nestes experimentos, succinato foi utilizado como substrato e o BHT foi utilizado numa faixa de concentração de 10 a 100 μM. Além destes experimentos, foram realizados ensaios com mitocôndrias não-fosforilantes, nos quais a oligomicina (inibidor clássico da ATP sintase) foi utilizada. Succinato foi também utilizado como substrato e o BHT testado numa faixa de concentração entre 2x10-9 a 10-4 M. Além disso, foi avaliado o efeito do BHT e de outros 13 antioxidantes diferentes sobre a produção de ROS em mitocôndrias intactas. A produção de ROS foi estimada através da medição do aumento de fluorescência linear (504 nm para excitação e 529 nm para emissão) devido à formação de 2'-7'-diclorofluoresceína (DCF) via oxidação por H2O2 na presença de peroxidase de raiz forte, utilizando succinato como substrato. Por fim, a capacidade antioxidante química in vitro do BHT e destes 13 antioxidantes foi avaliada utilizando os ensaios do ABTS e do DPPH. Não foram encontrados sinais de que o BHT desacopla a fosforilação oxidativa no fígado perfundido de forma significativa, embora estes efeitos pareçam estar claros em mitocôndrias isoladas. Contrariamente ao que se espera de um desacoplador, o BHT não estimulou o consumo de oxigênio nem inibiu a neoglicogênese a partir do lactato. Isso porque na faixa de concentração até 200 μM não houve inibição da produção de glicose ou do consumo de oxigênio. Apenas nas concentrações de 500 μM pequenos aumentos em ambos os parâmetros foram encontrados. A produção de piruvato apresentou uma tendência a aumento na concentração de 50 μM, seguido por um pico com 100 μM, com posterior retorno aos níveis basais. Em virtude de relatos que o BHT poderia desacoplar a fosforilação em concentrações muito baixas (10-9 to 10-6 M), também foram feitos experimentos na concentração de 1 μM (10-6 M), porém não foram observadas modificações no consumo de oxigênio, produção de glicose e piruvato. A transformação da frutose em glicose também não foi afetada pelo BHT. Apenas na concentração de 100 μM a produção de lactato a partir de frutose foi aumentada para um grau apreciável. Porém na passagem de 100 a 200 μM a produção de lactato retornou às taxas basais. Paralelamente ao aumento na produção de lactato, houve um pequeno aumento no consumo de oxigênio apenas na concentração de 200 μM e uma tendência crescente na produção de piruvato. Estes resultados demonstram, portanto, a ausência de uma ação inibitória do BHT sobre a síntese de glicose, o que sugere uma interação muito fraca do composto com a cadeia respiratória das mitocôndrias dentro das células hepáticas. O efeito desacoplador do BHT em mitocôndrias isoladas foi confirmado, mas apenas em concentrações acima de 10 μM...
Abstract: Butylated hydroxytoluene (BHT) is amply utilized as an antioxidant in industrially processes foods, cosmetics, pharmaceutical and petrochemical products. It is also commercialized in the form of capsules as a food and health supplement. As antioxidant, BHT inhibits lipid peroxidation, an effect that it also exerts in biological systems. There is also a universal consensus that ingestion of molecular species able to scavenge free radicals (antioxidants) can, in part at least, prevent the deleterious effects of the reactive oxygen species (ROS). The mitochondrial ROS production can contribute significantly to damages to the organelles in several pathologies. For this reason, good free radical scavengers should be active at the lowest possible concentration, allowing the ingestion of lowest possible doses. The evaluation of the antioxidant activity of a given substance is usually assessed by chemical methods, such as those ones based on the capacity of scavenging free radicals generated by the compounds 2,2 -azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH). There is obviously no guarantee that a given substance active in scavenging free radicals in an artificial system will also be able to scavenge with the same efficiency the reactive oxygen species produced in the mitochondria, for example. In addition to its effects as antioxidant, potential adverse effects of BHT were already reported. For example, there are studies showing that BHT labilizes the lisosomal membranes and disorganizes the mitochondrial structure, facts that could suggest that BHT interferes with cellular metabolism. In fact, there are reports that BHT affects mitochondrial functioning by, at least, two different mechanisms: uncoupling between electron transfer and oxidative phosphorylation and inhibition of complex I of the electron transport chain. This data suggest, in theory, that BHT should either stimulate or inhibit oxygen uptake, stimulate catabolic pathways and inhibit anabolic pathways. Such actions, beside others, have been clearly demonstrated to occur with several uncouplers and respiratory inhibitors. Taking into account what was exposed above, this work has two main objectives: 1) to conduct a systematic study on the effects of BHT on the rat liver, using both the isolated perfused rat liver and isolated mitochondria; 2) to compare the free radical scavenging activity of BHT and other well known antioxidants in chemical systems and in isolated mitochondria. Regarding the latter aspect, this study should clarify about the real antioxidant potential of BHT and several other antioxidants in a biological system (ROS generation in mitochondria). Male Wistar rats weighing 200 280 g were used in all experiments. All experiments were done in accordance with the worldwide accepted ethical guidelines for animal experimentation and were previously approved by the Ethics Committee of Animal Experimentation of the University of Maringá (protocol n. 9120290915). Isolated perfused rat liver experiments were done using hemoglobin-free, non-recirculating perfusion (Krebs/Henseleit-bicarbonate buffer, pH 7.4, saturated with O2:CO2 in the proportion of 95:5). BHT was dissolved into the perfusion fluid and infused in the concentration range of 1-500 μM. Lactate and fructose were used as gluconeogenic substrates. Samples of the perfusion fluid were collected and enzymatically analysed for glucose, lactate and pyruvate. Oxygen uptake was continuously monitored by a platinum electrode. The mitochondrial respiratory activity was evaluated by two different assays. The first one was the classical assay in which intact phosphorylating mitochondria were used. Succinate was used as the substrate and the rate of oxygen uptake in the presence (state III) or in the absence (state IV) of ADP was measured, as well as the respiratory control ratio (RC). The final BHT concentrations in this assay were in the range between 10 and 100 μM. Besides this, assays with non-phosphorylating mitochondria were also performed, with the addition of oligomycin (a classical inhibitor of ATP synthase). Succinate was also used as the substrate and BHT was tested in the range between 2x10-9 to 10-4 M. The effects of BHT and 13 other antioxidants on ROS production in mitochondria were also investigated. The rate of mitochondrial ROS production was estimated by measuring the linear fluorescence increase (504 nm for excitation and 529 nm for emission) due to 2 -7 -dichlorofluorescein (DCF) formation from the reduced form of 2 -7 -dichlorofluorescein (DCFH) via oxidation by H2O2 in the presence of horseradish peroxidase, using succinate as substrate. Finally, the in vitro chemical antioxidant capacities were evaluated using both the 2,2 -azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) and the 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) assays. We did not found any signs that BHT uncouples oxidative phosphorylation nor that it inhibits the respiratory chain in the perfused liver in a significant way, although these effects seem to be clear in isolated mitochondria. Contrary to what is expected from uncouplers, BHT did not significantly stimulate oxygen uptake nor had an inhibitory action on glucose synthesis from lactate. Actually, there was no inhibition of glucose synthesis or oxygen consumption in the concentration range up to 200 μM. Only at the BHT concentration of 500 μM small increments in both parameters were found. Pyruvate production presented an increasing tendency at 50 μM, followed by a peak increment at 100 μM and a subsequent return to the basal levels. Experiments were also done with very low concentrations of BHT, namely 1 μM (10-6 M), by virtue of the report that BHT might uncouple phosphorylation at very low concentrations (10-9 to 10-6 M). However, no modifications of oxygen uptake, glucose production and pyruvate production were found at low concentrations. Transformation of fructose into glucose was also not affected by BHT. Only lactate production was slightly increased at the concentration of 100 μM...
URI: http://repositorio.uem.br:8080/jspui/handle/1/1448
Appears in Collections:2.1 Dissertação - Ciências Agrárias (CCA)

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