Uso de dipeptídeo de metionina sobre a morfometria, parâmetros sanguíneos e oxidativos e expressão de genes associados ao transporte de aminoácidos, sistema imune em frangos de corte desafiados por Eimeria spp

Abstract

Resumo: O crescimento do animal é dependente, de diversos fatores, dentre estes, a obtenção adequada de nutrientes pelo intestino, uma vez que, o máximo potencial de crescimento é limitado pela taxa de nutrientes disponíveis no organismo. A coccidiose é uma doença infecciosa comum na avicultura mundial, causada por protozoários do gênero Eimeria, e é caracterizada por causar vários danos no intestino delgado e ceco das aves, com prejuízos sobre os processos de digestão e absorção dos nutrientes, e por afetar o desempenho animal. O fornecimento de rações com nutrientes essenciais como, por exemplo, a metionina, quando suplementada em níveis adequados pode ser útil para aliviar os efeitos negativos produzidos por esses agentes patogênicos. Nesse sentido, este trabalho teve como principal objetivo avaliar os efeitos do desafio por Eimeria spp. e da suplementação de metionina na forma de aminoácido livre (DL-Met) e de dipeptídeo (DL-MMet) sobre o desempenho, peso relativo de órgãos, estado redox, expressão de genes envolvidos com o transporte de aminoácidos e peptídeos, genes envolvidos no sistema defesa antioxidante e imune, genes relacionados com a produção de mucina, apoptose e proliferação celular no jejuno, bem como parâmetros morfométricos do jejuno e parâmetros sanguíneos. Para isto, frangos de corte machos de 10 dias de idade, foram divididos em seis tratamentos referentes ao desafio por Eimeria spp. (aves desafiadas: EC; ou aves não desafiadas: UC) e suplementação de metionina (sem suplementação de metionina: NS, suplementação de metionina na forma de aminoácido livre: DL-Met, e suplementação de metionina na forma de dipeptídeo: DL-MMet). Aos 14 dias de idade, os animais pertencentes ao grupo experimental EC receberam por via oral 1 mL de solução contendo oocistos esporulados de Eimeria spp. (E. acervulina, E. maxima, E. praecox e E. mitis). O restante dos animais (UC) receberam por via oral 1 mL de solução salina. Os animais foram abatidos por deslocamento cervical seis dias depois da inoculação (6 dpi), aos 20 dias de idade. Capítulo IV: Neste experimento, os frangos foram desafiados com quatro espécies de Eimeria (E. acervulina, E. maxima, E. praecox e E. mitis). Seis dias depois da inoculação, os animais foram abatidos e o jejuno foi coletado. Foi avaliado o desempenho dos animais, peso relativo dos órgãos, o estado redox do jejuno e a expressão de genes relacionados ao processo de absorção de aminoácidos e peptídeos, sistema antioxidante e imune no jejuno. Foi observado que os frangos EC apresentaram uma redução de 13% no consumo de ração, (CR), 37% de redução no ganho de peso (GP) e um aumento de 39% na taxa de conversão alimentar (CA). Com relação à suplementação de metionina, os frangos, consumindo a dieta DL-Met, apresentaram maior GP (aproximadamente 12% maior) e melhor CA (aproximadamente 12% menor), do que os frangos alimentados com a dieta NS. Frangos EC também apresentaram menor peso relativo da bursa de Fabricius (51,8%) e maiores pesos relativos do baço e do intestino total (delgado e grosso) (53,6% e 26,3%, respectivamente) do que os frangos UC. O desafio por Eimeria spp. causou um aumento nos níveis de nitrito e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no jejuno de frangos 6 dpi. Entre os frangos UC, aqueles, consumindo a dieta DL-Met, apresentaram maior capacidade antioxidante total (TAC) e menor atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD). Frangos EC, consumindo a dieta NS, também apresentaram maior teor de proteína carbonilada (CP) no jejuno 6 dpi. Adicionalmente, foi observado que os frangos alimentados com as dietas DL-Met e DL-MMet apresentaram menor teor de nitrito. O desafio por Eimeria spp. suprimiu a expressão dos genes catalase (CAT), superóxido dismutase 1 (SOD1), transportador de aminoácido neutros 1 (B0AT1), transportador de peptídeos 1 (PEPT1), receptor toll like 5 (TLR5), interleucina 2 (IL2), e ocludina (OCLN). O desafio por Eimeria spp. aumentou a expressão dos genes transportador de aminoácidos catiônicos 1 (CAT - 1) e interferon gama (INFG) no jejuno 6 dpi. O maior nível de expressão de PEPT1 foi observado em frangos alimentados com a dieta DL-MMet, e o menor nível de expressão do TLR5 foi observado em frangos consumindo a dieta NS. Capítulo V: Neste experimento, os frangos foram desafiados com Eimeria spp. (E. acervulina, E. maxima, E. praecox e E. mitis), e seis dias depois da inoculação, os animais foram abatidos para a coleta de sangue e do jejuno. Foi avaliado o desempenho dos animais, a morfometria do jejuno, a quantificação de células caliciformes neutras e ácidas, e os linfócitos intraepiteliais (LIEs) no jejuno. Também foi avaliada no jejuno a expressão de genes relacionados à produção de mucina e genes envolvidos nas vias de apoptose e proliferação celular. Adicionalmente, foi avaliada a atividade das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e creatina quinase (CK), e o conteúdo de ácido úrico (AU) e creatinina (Cr) no plasma sanguíneo. No soro sanguíneo, foi avaliado o conteúdo de mucoproteínas (MUCO) e proteínas totais (PT). Foi observado que os animais desafiados por Eimeria spp. apresentaram pior desempenho independentemente da dieta consumida. Com relação à suplementação de metionina, os animais, recebendo a dieta DL-Met, apresentaram maior GP e menor CA. Os animais do grupo EC recebendo dieta NS, apresentaram vilosidades mais baixas e mais largas, com maior valor de profundidade de cripta, menor relação vilo:cripta, menor quantidade de células caliciformes neutras e menor expressão do gene mucina 2 (MUC2). Além disso, os animais EC, consumindo a dieta NS, apresentaram também a menor área de superfície de absorção do jejuno. Os animais EC, consumindo a dieta DL-MMet, apresentaram maior altura dos enterócitos, e também observamos que os animais EC apresentaram maior largura da lâmina própria que os animais UC. Houve efeito da dieta sobre a largura da lâmina própria: animais consumindo a dieta DL-MMet apresentaram menor valor de largura da lâmina própria. Animais UC, consumindo a dieta DL-Met, apresentaram maior quantidade de células caliciformes ácidas, e os animais EC, recebendo a dieta DL-MMet, apresentaram a maior quantidade de LIEs. Os animais EC apresentaram menor expressão dos genes caspase 3 (CASP3), linfoma de células B2 (BCL2), alvo mecanicista da rapamicina (MTOR) e proteína ribossomal quinase B1 (RPS6KB1) do que os animais UC. A atividade das enzimas AST e CK também foi influenciada pela presença do patógeno com maiores valores em animais EC e NS. Os animais EC apresentaram menor conteúdo de AU. A produção de MUCO foi maior nas aves EC, e o menor conteúdo de PT foi observado nas aves EC, consumindo a dieta DL-MMet. Em resumo, esses resultados confirmam que o desafio por Eimeria spp. prejudica o desempenho dos animais. Possivelmente, como consequência da indução da resposta imune e do estresse oxidativo, que junto com a progressão da coccidiose, causa a destruição celular do jejuno, afetando negativamente a expressão de importantes genes que codificam proteínas transportadoras de nutrientes. A maior parte dos resultados são inéditos, e mostram que a suplementação com metionina como aminoácido livre ou dipeptídeo ajuda a proteger as células intestinais de frangos de corte sob condição de desafio por Eimeria spp., contra o dano oxidativo principalmente através da sua função antioxidante. Foi possível concluir ainda, que a suplementação de metionina na forma de dipeptídeo nas dietas de frangos, sobretudo em condições de desafios sanitários, poderia funcionar como um importante elemento capaz de manter a morfologia e função das células intestinais

Abstract: The growth of the animal is dependent of several factors, among them, the adequate obtaining of nutrients by the intestine, since, the maximum potential of growth is limited by the rate of available nutrients in the organism. Coccidiosis is a common infectious disease in poultry farming worldwide, caused by protozoa of the genus Eimeria, and it is characterized by causing various damages to the small intestine and cecum of birds, impairing the processes of digestion and absorption of nutrients, and by affecting performance animal. The provision of feed with essential nutrients such as methionine when supplemented at appropriate levels may be useful to alleviate the negative effects produced by such pathogens. In this sense, this work had as main objective to evaluate the effects of the challenge by Eimeria spp. and methionine supplementation in the form of free amino acid (DL-Met) and dipeptide (DL-MMet) on performance, relative weight of organs, redox state, expression of genes involved in the transport of amino acids and peptides, genes involved in the antioxidant and immune defense system, genes related to mucin production and cell proliferation in the jejunum, as well as morphometric parameters of the jejunum and blood parameters. For this, male broilers from 10 days of age were divided in six treatments related to the challenge by Eimeria spp. (challenged birds: EC, or unchallenged birds: UC), and methionine supplementation (non-supplemented: NS, methionine supplementation in free amino acid form: DL-Met, and methionine supplementation in the form of dipeptide: DL-MMet). At 14 days of age the animals belonging to the experimental group EC received orally 1 mL of solution containing sporulated oocysts of Eimeria spp. (E. acervulina, E. maximus, E. praecox and E. mitis). The rest of the animals (UC) received orally 1 mL of saline solution. The animals were slaughtered by cervical dislocation six days after inoculation (6 dpi) at 20 days of age. Chapter IV: In this experiment the broilers were challenged with four species of Eimeria (E. acervulina, E. maxima, E. praecox and E. mitis). Six days after inoculation the animals were slaughtered and the jejunum was collected. The performance of the animals, relative weight of organs, the redox state of the jejunum, and the expression of genes related to the process of amino acid and peptides absorption, antioxidant and immune system in the jejunum were evaluated. It was observed that EC chickens presented a 13% reduction in feed intake (FI), 37% reduction in body weight gain (BWG) and a 39% increase in feed conversion rate (FCR). With regard to methionine supplementation, chickens consuming the DL-Met diet presented higher WG (about 12% higher) and better FCR (about 12% lower) than chickens fed the NS diet. EC broilers also had lower relative weight of Fabricius bursa (51.8%), higher relative weights of the spleen and whole intestine (53.6% and 26.3%, respectively) than UC broilers. The challenge for Eimeria spp. caused an increase in the levels of nitrite and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in the chicken jejunum 6 dpi. Among the UC chickens, those consuming the DL-Met diet presented higher total antioxidant capacity (TAC) and lower activity of antioxidant catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzymes. EC chickens consuming the NS diet, also presented higher carbonylated protein (CP) content in the jejunum 6 dpi. Additionally, it was observed that the broilers fed the DL-Met and DL-MMet diets presented lower levels of nitrite. The challenge for Eimeria spp. suppressed the expression of the catalase (CAT), superoxide dismutase 1 (SOD1), neutral amino acid transporter (B0AT1), peptide transporter 1 (PEPT1), toll like receptor 5 (TLR5), interleukin 2 (IL2), and occludin (OCLN) genes. The challenge for Eimeria spp. increased expression of the cationic amino acid 1 transporter (CAT - 1) and interferon gamma (INFG) genes in the jejunum 6 dpi. The highest level of PEPT1 expression was observed in broilers fed the DL-MMet diet, and the lowest level of TLR5 expression was observed in chickens consuming the NS diet. Chapter V: In this experiment the chickens were challenged with Eimeria spp. (E. acervulina, E. maxima, E. praecox and E. mitis), and six days after inoculation the animals were slaughtered for blood and jejunum collection. The performance of the animals, jejunum morphometry, quantification of neutral and acidic goblet cells, and intraepithelial lymphocytes (LIEs) in the jejunum were evaluated. The expression of genes related to the production of mucin, and genes involved in apoptosis and cell proliferation pathways were also evaluated in the jejunum. Additionally the activity of the enzymes aspartate aminotransferase (AST) and creatine kinase (CK), and the content of uric acid (AU) and creatinine (Cr) in blood plasma were evaluated. In the blood serum the content of mucoproteins (MUCO) and total proteins (PT) were evaluated. It was observed that the animals challenged by Eimeria spp. presented worse performance independently of the diet consumed. With respect to methionine supplementation, animals receiving the DL-Met diet presented higher WG and lower FCR. The animals of the EC group receiving NS diet had lower and wider villi, with a greater value of crypt depth, lower villus:crypt ratio, less amount of neutral goblet cells and lower expression of the mucin gene 2 (MUC2). In addition, EC animals consuming the NS diet also had the smallest surface area of jejunum absorption. The EC animals consuming the DL-MMet diet showed higher height of the enterocytes, and we also observed that the EC animals showed a greater width of the lamina propria than the UC animals. There was diet effect on the width of the lamina propria: animals consuming the diet DL-MMet showed lower width value of the lamina propria. UC animals consuming the DL-Met diet presented higher amount of acidic goblet cells, and the EC animals receiving the DL-MMet diet had the highest number of LIEs. EC animals showed lower expression of caspase 3 (CASP3), B2-cell lymphoma (BCL2), mechanistic rapamycin target (MTOR) and ribosomal protein B1 (RPS6KB1) than UC animals. The activity of AST and CK enzymes was also influenced by the presence of the pathogen; with higher values in EC and NS animals. EC animals presented lower AU content. MUCO production was higher in EC birds, and lower PT content was observed in UC birds consuming the DL-MMet diet. In summary these results confirm that the challenge by Eimeria spp. impairs the performance of the animals. Possibly as a consequence of the induction of immune response and oxidative stress, which together with the progression of coccidiosis cause the cellular destruction of the jejunum, negatively affecting the expression of important genes encoding nutrient transport proteins. Most of the results are unpublished, and show that methionine supplementation as a free or dipeptide amino acid helps to protect intestinal cells from broiler chickens challenged by Eimeria spp. against oxidative damage mainly through its antioxidant function. It was also possible to conclude that methionine supplementation in the dipeptide form in broiler diets, especially under conditions of health challenges, could function as an important element capable of maintaining the morphology and function of intestinal cells