Transporte dos glicosídeos da estévia através da bicamada lipídica

Abstract

Resumo: Os glicosídeos da estévia apresentam potencial terapêutico anti-diabetogênico e anti-hipertensivo. Porém, não há um consenso na literatura quanto ao mecanismo de transporte dos glicosídeos da estévia e suas agluconas através de membranas celulares. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o transporte das agluconas esteviol, isoesteviol e do glicosídeo esteviolbiosídeo através da bicamada lipídica por meio de espectroscopia de fluorescência. Lipossomas (large unilamellar vesicles - LUVs) de egg-PC foram formados por extrusão. As sondas fluorescentes piranina (sensível a pH) e calceína foram encapsuladas nas LUVs, enquanto que a sonda FPE (sensível a cargas de superfície) foi inserida seletivamente na monocamada externa da bicamada lipídica. As soluções estoque dos produtos da estévia foram preparadas em DMSO ou em BSA (2 mol de produto:1mol de BSA). A ligação dos produtos da estévia a BSA foi caracterizada pela fluorescência intrínseca da BSA (resíduos de triptofano). O raio hidrodinâmico das LUVs foi medido pela técnica de DLS (Dynamic light scattering). A ligação dos produtos da estévia à BSA foi evidenciada pela supressão da fluorescência intrínseca da BSA. A constante de ligação à 37 °C, calculada a partir dos dados experimentais, indicaram uma maior afinidade do esteviolbiosídeo pela BSA. Entretanto, o esteviol e isoesteviol, promoveram um deslocamento hipsocrômico (blue shift) no espectro de emissão da BSA, indicativo do aumento na hidrofobicidade ao redor dos resíduos de triptofano. O esteviol e o isoesteviol promoveram uma rápida (em segundos) redução e recuperação da fluorescência do FPE, condizentes com a ligação da forma ionizada e carregada negativamente à monocamada externa seguida de sua difusão (flip-flop), respectivamente. Nos ensaios com piranina, o esteviol, isoesteviol e em menor extensão o esteviolbiosídeo, causaram uma rápida (em segundos) redução da fluorescência da piranina, um indicativo de acidificação do meio intravesicular. Esses dados refletem a difusão da forma protonada dos produtos da estévia através da bicamada lipídica, com o posicionamento dos grupamentos ionizáveis na interface água/membrana e entrega de prótons para interior das LUVs. Os produtos da estévia não afetaram o raio hidrodinâmico das LUVs e não induziram o vazamento de calceína encapsulada, ou seja, não alteraram a organização estrutural da bicamada lipídica que justificassem a difusão transmembrana dessas moléculas assim como o vazamento das sondas FPE e piranina. Portanto, os resultados apresentados, inéditos na literatura, indicam que as agluconas esteviol e isoesteviol são capazes de se ligarem e atravessarem membranas lipídicas por difusão simples e que a permeabilidade da bicamada lipídica ao esteviolbiosídeo é bastante reduzida

Abstract: The stevia glycosides present anti-diabetogenic and antihypertensive actions. However, there is no consensus in the literature regarding the transport mechanism of glycosides and their aglucones across cell membranes. Thus, the objective of this work was to evaluate the transmembrane transport of the steviol, isoesteviol and steviolbioside by means of fluorescence spectroscopy. Liposomes (large unilamellar vesicles - LUVs) of egg-PC were prepared by extrusion. Pyranin (pH probe) and calcein were encapsulated in LUVs. FPE (charge surface probe) was selectively inserted into the outer monolayer of the lipid bilayer. Stock solutions of stevia products were prepared in DMSO or BSA (2 mol of product: 1 mol of BSA). The binding of stevia products to BSA was characterized by the BSA intrinsic fluorescence (tryptophan residues). The hydrodynamic radius was measured by DLS (Dynamic light scattering). The binding of the stevia products to BSA caused fluorescence suppression. The steviolbioside binding constant at 37 °C, calculated from the experimental data, was higher than those calculated for steviol and isoesteviol. Furthermore, the aglucones induced a blue shift in the BSA emission spectrum probably due to an increase in hydrophobicity around the tryptophan residues. In the FPE assay, steviol and isosteviol promoted a rapid (in seconds) reduction in FPE fluorescence followed by a recovery towards to the base line. These results are explained by the binding and flip-flop of the ionized molecules. In the piranine assay, steviol, isosteviol and, to a lesser extent, steviolbioside, caused a rapid (in seconds) reduction of the pyranin fluorescence without recovery when BSA was used as vehicle. These results reflect the binding and flip-flop of the protonated molecules, with delivery of protons to the LUVs interior. The stevia products did not affect the LUV hydrodynamic radius and did not induce calcein leakage. These results indicate that the structural organization of the lipid bilayer was not affected by the binding of stevia products. Therefore, this study indicate that steviol and isosteviol are able to bind and cross lipid membranes by simple diffusion and the permeability of lipid bilayer to steviolbioside is quite reduced