Caracterização da lipase ligada ao micélio e da esterase secretada de Aspergillus westerdijkiae

Abstract

RESUMO: Esterases e lipases são enzimas lipolíticas que atuam sobre triglicerídeos. Elas podem hidrolisar as ligações éster ou formá-las nas reações de interesterificação, transesterificação e esterificação. Não só essas a/ß hidrolases compartilham os tipos de reações que podem catalisar, mas também compartilham muitas propriedades estruturais. Apesar destas semelhanças, as esterases hidrolisam ésteres simples e triglicerídeos contendo ácidos graxos com menos de seis carbonos, enquanto que as lipases preferem triglicerídeos com ácidos graxos de cadeia longa, insolúveis em água. Devido ao fato de que estas enzimas possuem alta regio- e estereoespecificidade, não requerem cofatores e são estáveis e muitas vezes ativas em solventes orgânicos, elas são muito valorizadas, especialmente na síntese orgânica. As lipases ganharam atenção especial devido à sua maior estabilidade em solventes orgânicos e especificidade de substrato mais ampla. No entanto, muitas aplicações de lipases, entre elas a produção de biodiesel, são impedidas pelo seu alto custo. O emprego de esterases na síntese de compostos opticamente puros colocou este grupo em evidência, mas seu uso também enfrenta problemas, principalmente devido à escassez de disponibilidade comercial e à enantioseletividade moderada. Esses obstáculos podem ser contornados de muitas maneiras diferentes e a descoberta de novos microrganismos lipolíticos e suas enzimas é uma das soluções mais diretas. Em busca da descoberta de novos fungos lipolíticos, um produtor foi isolado de tanques de coleta para a reciclagem de óleo de cozinha usado. Foi verificado que este fungo é produtor de uma esterase e uma lipase ligada ao micélio. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar sua lipase ligada ao micélio e avaliar seu possível uso na síntese orgânica. Além disso, este trabalho também teve como objetivo otimizar a produção de uma nova esterase, purificá-la e caracterizá-la. Uma bioprospecção de novos fungos lipolíticos foi realizada em amostras de óleo de cozinha usado coletadas de tanques para reciclagem e gordura coletada de uma caixa de gordura de uma casa localizada na cidade de Maringá, Paraná, Brasil. As amostras foram distribuídas em placas de ágar rodamina B contendo antibióticos para isolar fungos e avaliar a produção de lipase concomitantemente. Os fungos assim obtidos foram isolados por meio de isolamento monospórico e a sua capacidade de produzir esterases foi avaliada em placas de ágar tributirina. Os isolados foram identificados por meio de DNA barcoding, na qual a região do rDNA 5.8S-ITS foi amplificada por PCR e sequenciada, e a sequência obtida foi comparada com sequências em bancos de dados. Um produtor lipolítico não descrito foi identificado, o fungo Aspergillus westerdijkiae. Foi verificado que a fluorescência nas placas de ágar de rodamina B estava associada ao micélio devido à presença de uma lipase. Para estudar esta lipase ligada ao micélio, o fungo foi cultivado em meio basal contendo óleo de oliva para obter um micélio fresco. O micélio foi coletado por filtração sob vácuo em papel de filtro e desengordurado com acetona. A acetona foi removida por evaporação e o micélio foi liofilizado e moído a um pó. A atividade enzimática foi avaliada medindo a taxa de hidrólise do p-nitrofenil palmitato (p-NPP) ou titulação. Várias propriedades da lipase ligada ao micélio foram avaliadas, a saber, inducibilidade por óleo de oliva, efeito da concentração do p-NPP na velocidade inicial, reciclabilidade, temperatura ótima, estabilidade térmica, pH ótimo, estabilidade em diferentes pHs, especificidade de substrato, potenciais inibidores e ativadores, e capacidade de esterificar o ácido oleico com etanol. Foi verificado nas placas de ágar tributirina que o fungo também produz esterase. Assim, em outro trabalho, uma esterase secretada foi estudada. Em primeiro lugar, uma curva de crescimento e produção de esterase foi realizada em meio basal contendo óleo de oliva. Após a separação do micélio do meio por filtração sob vácuo em papel de filtro, a atividade da esterase foi avaliada no filtrado. A atividade enzimática foi avaliada pela hidrólise do p-nitrofenil butirato (p-NPB) ou titulação. Vários parâmetros, a saber, diferentes óleos, tamanho de inóculo, pH inicial, adição de carboidratos e íons, presença e ausência de agitação, luz e emulsificantes foram avaliados passo a passo para otimizar a síntese de esterase. A purificação da esterase foi realizada com o filtrado de uma cultura de 10 frascos nas condições otimizadas. As proteínas do filtrado foram precipitadas com sulfato de amônio, dialisadas e aplicadas numa coluna cromatográfica Sephacryl S-200 HR. Foram analisadas diferentes características da esterase purificada, isto é, KM e Vmáx, pH ótimo, estabilidade em diferentes pHs, temperatura ótima, estabilidade térmica, especificidade de substrato, potenciais inibidores e ativadores, e resistência a solvente orgânico. Além disso, a esterase foi analisada por espectrometria de massa MALDI-TOF/TOF. A presença de uma lipase ligada ao micélio de A. westerdijkiae foi confirmada pela dependência da velocidade inicial em relação à concentração de p-NPP (rendimento médio de atividade de 40.000 U/g de micélio) e sua atividade contra o óleo de oliva (52 U/g de micélio) e tributirina (78 U/g de micélio). Além disso, a produção de lipase ligada ao micélio foi induzida por óleo de oliva. Foi verificado que a enzima também pode ser usada repetidamente, mantendo 35,8% de sua atividade após a terceira rodada de reação contra p-NPP. A temperatura ótima encontrada foi de 40 oC, permanecendo estável a 50 oC por 6 horas, mantendo 81% de sua atividade, e apresentou uma T50 calculada de 62 oC. Além disso, mostrou um pH ótimo de 7,0, mas pôde atuar com mais de 50% de atividade na faixa de pH de 5,0 a 9,0. A lipase ligada ao micélio foi inibida pelos íons Na+, Ca +2, Hg +2, Ni+2, pelos compostos EDTA e PMSF e pelos detergentes não iônicos Tween 20, Tween 80 e Triton X-100. A enzima apresentou atividade contra diferentes ésteres de ácidos graxos de p-nitrofenil, além do palmitato, a saber, p-nitrofenil acetato (C2), butirato (C4) e dodecanoato (C12). A capacidade da lipase ligada ao micélio de esterificar em solvente orgânico foi verificada em n-heptano, ao qual foram adicionados ácido oleico e etanol. A formação de oleato de etila foi confirmada por TLC e um rendimento máximo de conversão de 35% foi obtido. A curva de crescimento e de produção da esterase de A. westerdijkiae mostrou um pico de produção após três dias de cultura. Após testar vários parâmetros, foram encontradas as melhores condições para a produção da esterase, com as quais uma atividade máxima de 24 U/mL de filtrado foi alcançada. O tamanho da esterase purificada foi estimado em 32 kDa por SDS-PAGE. De todos os substratos testados, a esterase mostrou apenas atividade contra os ésteres de cadeia curta, o p-nitrofenil butirato (100% da atividade relativa) e p-nitrofenil acetato (6,1%). A enzima apresentou uma temperatura ótima de 40 oC, manteve 60% de sua atividade após 8 horas de incubação na mesma temperatura e a T50 calculada foi de 49 oC. A enzima mostrou um perfil alcalino, com a melhor atividade na faixa de pH de 7,0 a 9,0 e pH ótimo de 8,0. A enzima permaneceu estável em uma ampla gama de pHs (5,0 a 9,0) após 6 horas de incubação. O KM e a Vmáx foram de 638 µM para p-NPB e 5,47 µM de p-nitrofenol liberado . min-1 . µg-1 de proteína, respectivamente. A enzima foi parcialmente ativa na presença de 25% de acetona, etanol, metanol, isopropanol e acetonitrila. A atividade da esterase foi fortemente inibida por Hg +2, Ni+2, PMSF, EDTA e pelos detergentes não iónicos Triton X-100, Tween 20 e Tween 80, enquanto foi ativada por K +, Na + e SDS. Sequências de peptídeos da esterase obtidas por espectrometria de massa permitiram que a proteína fosse encontrada no genoma anotado de A. westerdijkiae e seu modelo estrutural revelou que a proteína é de fato um membro da superfamília das a/ß-hidrolases. Conclusões. Um novo fungo lipolítico foi identificado neste estudo. Duas enzimas lipolíticas, i.e., uma lipase ligada ao micélio e uma esterase secretada, foram caracterizadas e ambas as enzimas apresentaram propriedades que podem se revelar muito úteis em diferentes aplicações biotecnológicas

ABSTRACT: Esterases and lipases are lipolytic enzymes that act on triglycerides. They can either hydrolyze ester bonds or form them in interesterification, transesterification, and esterification reactions. Not only do these a/ß hydrolases share the reactions types they can catalyze, but also many structural properties. Despite these similarities, esterases hydrolyze simple esters and triglycerides containing fatty acids shorter than six carbons, whereas lipases prefer triglycerides with long-chain fatty acids, insoluble in water. Owing to the fact that these enzymes have high regio- and stereospecificity, do not require cofactors, and are stable and often active in organic solvents, they are greatly valued, especially in organic synthesis. Lipases have gained special attention because of their greater stability in organic solvents and broader substrate specificity. Nonetheless, many applications of lipases, among which is the production of biodiesel, are impeded by their high cost. The employment of esterases in the synthesis of optically pure compounds has brought this group into focus, but their use also faces problems, mainly due to their scarce commercial availability and moderate enantioselectivity. These obstacles can be circumvented in many different ways and the discovery of new lipolytic microorganisms and their enzymes is one of the most straightforward solutions. In pursuance of the discovery of new lipolytic fungi, a producer has been isolated from collection recipients for the recycling of cooking oil. This fungus was found to produce an esterase and a mycelium-bound lipase. The objectives of this work were to characterize its mycelium-bound lipase and assess its possible use in organic synthesis. Furthermore, this work also intended to optimize the production of a new esterase, purify, and characterize it. A bioprospection for new lipolytic fungi was carried out in samples of used cooking oil collected from recycling tanks and fat collected from a private house grease trap in the city of Maringá, Paraná, Brazil. The samples were distributed on rhodamine B agar plates containing antibiotics in order to concomitantly isolate fungi and evaluate lipase production. The fungi thus obtained were isolated by means of monosporic isolation and their ability to produce esterases were assessed with tributyrin agar plates. The isolates were identified by dint of DNA barcoding, in which the 5.8S-ITS rDNA region was amplified by PCR, sequenced, and the obtained sequence was compared with sequences in data banks. An unreported lipolytic producer was identified, o fungo Aspergillus westerdijkiae. Fluorescence in Rhodamine B agar plates was found to be associated with its mycelium due to the presence of a lipase. In order to study this mycelium-bound lipase, the fungus was cultivated in a basal medium containing olive oil so as to obtain fresh mycelium. The mycelium was collected by vacuum filtration on filter paper and defatted with acetone. The acetone was removed by evaporation and the mycelium was freeze-dried and ground to a powder. The enzymatic activity was evaluated by measuring the hydrolysis rate of p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) or by titration. Various properties of the mycelium-bound lipase were assessed, namely, inducibility by olive oil, effect of p-NPP concentration on initial velocity, potential recyclability, optimal temperature, thermal stability, optimal pH, pH stability, substrate specificity, effect of potential inhibitors and activators, and its ability to esterify oleic acid with ethanol. In tributyrin agar plates, the fungus was also found to produce esterase. Thus, in another work, a secreted esterase was studied. First, a five-day time course of fungi growth and esterase production was performed in a basal medium olive oil. After separation of the mycelium from the medium by vacuum filtration on filter paper, the esterase activity was assessed in the filtrate. The enzymatic activity was evaluated by the hydrolysis of p-nitrophenyl butyrate (p-NPB) or titration. Various parameters, viz. different oils, inoculum size, initial pHs, addition of carbohydrates and ions, presence and absence of agitation, light, and emulsifiers were assessed stepwise in order to optimize the esterase synthesis. The esterase purification was achieved with the filtrate of a 10-flask culture in the optimized conditions. The proteins of the filtrate were precipitated with ammonium sulphate, dialyzed, and applied on a Sephacryl S-200 HR chromatographic column. Different characteristics of the purified esterase were analyzed, viz., its KM and Vmax, optimal pH, pH stability, optimal temperature, thermal stability, substrate specificity, potential inhibitors and activators, and organic solvent resistance. What is more, the esterase was analyzed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. The presence of a A. westerdijkiae mycelium-bound lipase was confirmed by the dependency of the initial velocity on p-NPP (average activity yield of 40,000 U/g of mycelium) and its activity against olive oil (52 U/g of mycelium) and tributyrin (78 U/g of mycelium). Furthermore, the mycelium-lipase production was confirmed to be induced by olive oil. The enzyme could also be used repeatedly, retaining 35.8% of its activity after the third round of reaction against p-NPP. The enzyme optimal temperature found was 40 oC. The enzyme remained stable at 50 oC for 6 hours, retaining 81% of its activity, and presented a calculated T50 of 62 oC. In addition, it showed an optimal pH of 7.0, but could act with more than 50% of activity in the range of 5.0 to 9.0. The mycelium-bound lipase was inhibited by the ions Na+, Ca+2, Hg+2, Ni+2, the compounds EDTA and PMSF and the non-ionic detergents Tween 20, Tween 80, and Triton X-100. The enzyme presented activity against different fatty acid esters of p-nitrophenol besides palmitate, namely, p-nitrophenyl acetate (C2), butyrate (C4), and dodecanoate (C12). The mycelium-bound lipase ability to esterify in organic solvent was verified in n-heptane, to which oleic acid and ethanol were added. The formation of ethyl oleate was confirmed by TLC and a maximum conversion yield of 35% was obtained. The A. westerdijkiae esterase biosynthesis and growth curve showed a production peak after three days of culture. After testing various parameters, it was found the best conditions for the esterase production, with which a maximum activity of 24 U/mL of filtrate was achieved. The size of the purified esterase was estimated to be 32 kDa by SDS-PAGE. From all the substrates tested, the esterase only showed activity against the short-chain esters p-nitrophenyl butyrate (100% of relative activity) and acetate (6.1%). The enzyme presented an optimum temperature of 40 oC, retained 60% of its activity after 8 hours of incubation at the same temperature and its calculated T50 was 49 oC. It showed an alkaline profile, with best activity in the pH range from 7.0 to 9.0 and optimum pH of 8.0. The enzyme was stable over a wide range of pHs (5.0 tp 9.0) after 6 hours of incubation. The KM and Vmax were 638 µM for p-NPB and 5.47 µmol of released p-nitrophenol . min-1 . µg-1 of protein, respectively. The enzyme was partially active in the presence of 25% acetone, ethanol, methanol, isopropanol, and acetonitrile. Esterase activity was strongly inhibited by Hg+2, Ni+2, PMSF, EDTA, and the non-ionic detergents Triton X-100, Tween 20, and Tween 80, while it was activated by K+, Na+, and SDS. Sequences of the enzyme peptides obtained mass spectrometry allowed the protein to be found in the A. westerdijkiae genome and its structure model revealed that the protein is indeed a member of the a/ß-hydrolase fold superfamily. A new lipolytic fungus has been identified in this study. Two new lipolytic enzymes, i.e., a mycelium-bound lipase and a secreted esterase, have been characterized and both enzymes showed properties that may prove to be very useful in different biotechnological applications