Regulação da atividade uridilil-removedora (UR) da enzima GlnD de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo: A disponibilidade de nitrogênio fixado é um dos principais fatores limitantes para a produtividade agrícola. Naturalmente, o processo de fixação do nitrogênio é realizado por microrganismos chamados de diazatróficos. Herbaspirillum seropedicae, alvo do nosso trabalho, é uma bactéria diazotrófica capaz de estimular o crescimento vegetal. O metabolismo de nitrogênio em H. seropedicae é regulado por um sistema molecular conhecido como Ntr ("nitrogen regulation system"). As proteínas GlnD e PII que pertencem à esse sistema, participam como sensores primários dos níveis de nitrogênio intracelular. As proteínas PII têm como função a transdução de sinal e regulam a atividade de outras proteínas do sistema Ntr através de interação física. GlnD, por sua vez, é uma proteína bifuncional, podendo adicionar ou remover grupamentos UMP à PII. Dependendo do nível de nitrogênio intracelular, a atividade de remoção ou adição dos grupos UMP é intensificada, causando uma cascata de reações, culminando com a adaptação da bactéria as condições ambientais. O presente trabalho foi planejado para verificar como é regulada a atividade de desuridililação da proteína GlnD selvagem e com mutações. Para isso foram avaliados os efeitos das concentrações de Mg2+, Mn2+, ATP, ADP, glutamina e 2-oxoglutarato. Plasmídeos de expressão contendo os genes que codificam as proteínas GlnD e GlnK de H. seropedicae foram usados para a superexpressão heteróloga dessas proteínas na estirpe BL21 de Escherichia coli. A expressão foi induzida com a adição de 0,5 mM de IPTG e ocorreu por 3 horas a 37°C para a proteína GlnK, e por 16 horas a 16°C para GlnD. Após serem superexpressas, as proteínas foram purificadas utilizando uma coluna de heparina (para GlnK) ou coluna de afinidade carregada com níquel (para GlnD). Para a construção de versões truncadas de GlnD de H. seropedicae, primeiramente foi realizada uma análise in silico dos domínios. A partir do resultado obtido foram construídas cinco versões diferentes de GlnD, utilizando oligonucleotídeos específicos para cada mutante. Os genes que expressam as proteínas GlnD mutantes foram amplificados e ligados ao vetor pET28a. As versões de GlnD mutantes foram superexpressas nos mesmos moldes da proteína GlnD selvagem. Devido a questões de solubilidade, o mutante GlnD?ACT foi a única versão a ser purificada. Com as proteínas GlnK, GlnD e GlnD?ACT purificadas, foram realizados testes para verificar os efeitos de efetores moleculares (Mg2+, Mn2+, ATP, ADP, glutamina e 2-oxoglutarato) na atividade de desuridililação. A atividade de GlnD foi verificada por análises do grau de modificação pós-traducional de GlnK através de eletroforese de gel de poliacrilamida não desnaturante. A quantificação das bandas proteicas visualizadas no gel foi feita com auxílio do programa ImageJ e os resultados foram plotados em gráficos expressos em quantidade relativa de monômeros de GlnK uridililados. Os principais resultados foram os seguintes: A atividade uridilil-removedora (UR) de GlnD de Herbaspirillum seropedicae é maior quando adicionado o íon Mn+2 em comparação com Mg+2; Glutamina estimulou a atividade UR, enquanto que 2-oxoglutarato (2-OG) inibiu a desuridililação; A adição de glutamina na concentração 10mM reverteu a inibição de 2-OG na concentração 2mM; O efeito inibitório de 2-OG só foi observado na presença de ATP, não ocorrendo quando somente ADP foi adicionado; Cinco versões do gene que expressa GlnD de H. seropedicae foram construídas, clonadas e transformadas nas estirpes TOP10 e BL21 de E. coli; GlnD?ACT foi a primeira versão a ser purificada e caracterizada; A enzima mutante GlnD?ACT teve sua atividade uridilil-transferase (UTase) desregulada, fazendo com que ocorresse um ciclo fútil de uridililação e posterior desuridililação; GlnD?ACT teve atividade UR diferente da enzima selvagem, perdendo sensibilidade ao 2-OG e à glutamina. Com os resultados obtidos, foi possível observar que a atividade UR de GlnD de H. seropedicae foi estimulada por glutamina e inibida por 2-OG. Com a adição de mais glutamina, foi observada que a inibição por 2-OG foi revertida, possivelmente pela competição desses dois efetores pela ligação em GlnD. Entretanto, os resultados com 2-OG mostraram que a atividade inibitória do efetor só foi verificada na presença de ATP, mostrando que isso pode ter ocorrido devido à ligação de 2-OG em PII ao invés de GlnD. Para verificar a atividade regulatória dos domínios de GlnD, foram construídas cinco versões diferentes do gene que expressa a proteína GlnD. A versão GlnD?ACT foi purificada e teve sua atividade caracterizada. Com relação à atividade UTase do mutante, foi observada que a enzima realiza um ciclo fútil de uridililação e desuridililação. Esse resultado mostra que o domínio ACT da enzima selvagem tem uma função reguladora, controlando tanto a atividade UTase quanto a UR. A atividade UR do mutante GlnD?ACT também foi diferente da encontrada na enzima selvagem, mostrando que essa versão perdeu a sensibilidade tanto por 2-OG quanto por glutamina. Esse resultado demonstra que 2-OG também se liga à GlnD na presença de ATP. Para confirmar as hipóteses, estudos adicionais serão realizados. O presente estudo demonstrou que a proteína GlnD de H. seropedicae possui características únicas que a diferem de outras proteínas ortólogas estudadas até o presente momento. O presente trabalho reúne evidências que 2-OG exerce efeito inibitório sobre a desuridililação por ligação direta em GlnD, ao mesmo tempo que possui uma forte evidência de que esse efeito sobre a desuridililação é por sua ligação à proteína PII. Para a solução dessa questão, novos experimentos serão realizados

Abstract: The availability of fixed nitrogen is one of the main limiting factors for agricultural productivity. Naturally, the nitrogen fixation process is performed by microorganisms called diazatrophs. Herbaspirillum seropedicae, the target of our work, is a diazotrophic bacterium capable of stimulating plant growth. The nitrogen metabolism in H. seropedicae is regulated by a molecular system known as Ntr ("nitrogen regulation system"). The GlnD and PII proteins belonging to this system participate as primary sensors of intracellular nitrogen levels. PII proteins function to signal transduction and regulate the activity of other Ntr proteins through physical interaction. GlnD, on the other hand, is a bifunctional protein, being able to add or remove UMP clusters to PII. Depending on the level of intracellular nitrogen, the removal or addition activity of the UMP groups is intensified, causing a cascade of reactions, which culminates with the adaptation of the bacteria to its environment. The present work was designed to verify how the wild-type and mutated GlnD protein deuridylylation activity is regulated. For this, the effects of Mg2+, Mn2+, ATP, ADP, glutamine and 2-oxoglutarate concentrations were evaluated. Expression plasmids carrying the H. seropedicae GlnK and GlnD proteins coding genes were used for heterologous overexpression of these proteins at the BL21 Escherichia coli strain. Expression was induced upon the addition of 0.5 mM IPTG and occurred for 3 hours at 37°C for the GlnK protein, and for 16 hours at 16°C for GlnD. After being overexpressed, the proteins were purified using a heparin- column (for GlnK) or a nickel-loaded affinity column (for GlnD). For the construction of truncated GlnD versions of H. seropedicae, an in silico analysis of the domains was first performed. From the result obtained five different versions of GlnD were constructed, using oligonucleotides specific for each mutant. The genes expressing the mutant GlnD proteins were amplified and ligated to the pET28a vector. The mutant GlnD versions were overexpressed in the same molds as the wild-type GlnD protein. Due to solubility issues, the GlnD?ACT mutant was the only version to be purified. With purified GlnK, GlnD and GlnD?ACT proteins, tests were performed to verify the effects of molecular effectors (Mg2+, Mn2+, ATP, ADP, glutamine and 2-oxoglutarate) on the deuridylylation activity. Protein samples were analyzed by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Quantification of the protein bands visualized on the gel was done with the aid of the ImageJ program and the results were plotted on graphs expressed in relative quantity of uridylylated GlnK monomers. The main results were as follows: The uridylyl-remover activity (UR) of GlnD from Herbaspirillum seropedicae is higher when Mn2+ ion is added compared to Mg2+; Glutamine stimulated UR activity, whereas 2-oxoglutarate (2-OG) inhibited deuridylylation; The addition of glutamine at 10mM concentration reversed the inhibition of 2-OG in 2mM concentration; The inhibitory effect of 2-OG was only observed in the presence of ATP, not occurring when only ADP was added; Five versions of the gene expressing GlnD from H. seropedicae were constructed, cloned and transformed into strains TOP10 and BL21 of E. coli; GlnD?ACT was the first version to be purified and characterized; The GlnD?ACT mutant enzyme had its unregulated uridylyl transferase (UTase) activity, causing a fuid cycle of uridylylation and subsequent deuridylylation; GlnD?ACT had UR activity different from the wild-type enzyme, losing sensitivity to 2-OG and glutamine. With the obtained results, it was possible to observe that the UR activity of GlnD of H. seropedicae was stimulated by glutamine and inhibited by 2-OG. With the addition of more glutamine, it was observed that the inhibition by 2-OG was reversed, possibly by the competition of these two effectors by GlnD binding. However, the results with 2-OG showed that the inhibitory activity of the effector was only verified in the presence of ATP, showing that this could have occurred due to the binding of 2-OG in PII instead of GlnD. To verify the regulatory activity of the GlnD domains, five different versions of the GlnD expressing gene gene were constructed. The GlnD?ACT version was purified and had its activity characterized. With respect to the UTase activity of the mutant, it was observed that the enzyme carries out a futile cycle of uridilylation and desuryldilylation. This result shows that the ACT domain of the wild-type enzyme has a regulatory function, controlling both UTase and UR activity. The UR activity of the GlnD?ACT mutant was also different from that found in the wild-type enzyme, showing that this version lost sensitivity by both 2-OG and glutamine. This result demonstrates that 2-OG also binds to GlnD in the presence of ATP. To confirm the hypotheses, additional studies will be conducted. The present study demonstrated that the GlnD protein of H. seropedicae has unique characteristics that differ from other orthologous proteins studied up to the present moment. The present work gathers evidence that 2-OG exerts an inhibitory effect on the deuridylylation by direct binding in GlnD, while it has strong evidence that this effect on deuridylylation is due to its binding to the PII protein. For the solution of this question, new experiments will be carried out