Efeitos da ingestão crônica de dieta contaminada com desoxinivalenol sobre parâmetros sanguíneos e jejuno de ratos wistar

Abstract

RESUMO: O desoxinivalenol (DON), micotoxina pertencente ao grupo B dos tricotecenos, é produzido principalmente por fungos do gênero Fusarium. Comumente encontrado em níveis elevados em todos os continentes é a micotoxina mais prevalente em culturas que constituem a base da alimentação humana e que são utilizadas na alimentação de animais. O sistema digestório é o primeiro e o principal alvo do DON, sendo que sua absorção ocorre primariamente no jejuno. Uma vez absorvido, o DON chega rapidamente a outros órgãos, atingindo em ordem decrescente de concentração, fígado, plasma, rim, baço, coração e cérebro. Desta maneira, o DON pode causar efeitos gastrointestinais, hepáticos, hematológicos, renais, esplênicos, cardíacos e neurais. Apesar de o DON afetar primariamente o sistema digestório e possivelmente atingir o sistema nervoso entérico (SNE), não existem estudos dos efeitos do DON sobre este. A ampla distribuição e os elevados níveis de contaminação por esta micotoxina têm levado vários países a regulamentar os níveis máximos de contaminação toleráveis para grãos e seus produtos derivados de consumo humano e animal. Vários trabalhos tem mostrado a ação do DON em doses superiores às regulamentadas como toleráveis para consumo, porém, testes de altas doses, nem sempre podem ser usados para prever os efeitos de baixas doses. Os trabalhos que compõem esta tese tiveram por objetivo avaliar os efeitos de uma dieta contaminada com DON em concentrações que se encontram dentro dos valores determinados como limite máximo tolerável (LMT) para consumo. No primeiro trabalho avaliou-se a ingestão alimentar, peso corporal, estado oxidativo e análises morfométricas de gliócitos e neurônios de gânglios mientéricos do jejuno de ratos Wistar. Para tanto, 40 ratos machos com 21 dias de idade foram distribuídos em cinco grupos que receberam, durante 42 dias, dieta contaminada com diferentes concentrações de DON (0; 0,2; 0,75; 1,75 e 2 mg/Kg de ração). No segundo trabalho avaliou-se a caracterização morfológica e o estado inflamatório do jejuno, assim como, parâmetros sanguíneos. Para isso, 24 ratos machos Wistar com 21 dias de idade foram distribuídos em três grupos e tratados por 42 dias, sendo, um grupo controle, um grupo que recebeu ração contaminada com DON na menor concentração estabelecida como LMT (0,2 mg/Kg) e um grupo que recebeu dieta contaminada com DON em concentração próxima as máximas estabelecidas como LMT (2 mg/Kg de ração). A menor concentração utilizada está próxima dos níveis de contaminação com DON encontrados em vários países, como na farinha de milho da África (0,294 mg/kg), em 95% das amostras de pães e biscoitos avaliados na China (0,1533 mg/kg) e em 83% das amostras de trigo analisadas na Polônia (0,1402 mg/kg). Todas as concentrações estão dentro dos valores estabelecidos como limites máximos de contaminação permitidos por alguns países. A União Europeia estabelece como LMT de contaminação por DON para trigo duro não processado, 1,75 mg/kg; para cereais não processados, 1,25 mg/kg; para massas e cereais processados destinados ao consumo humano direto, 0,75 mg/kg e para alimentos destinados à crianças, 0,2 mg/kg. No Brasil, atualmente o LMT de DON para trigo não processado é 3 mg/kg, para cereais processados, 1,25 mg/kg, para massas e biscoitos, 1,00 mg/kg, e para alimentos destinados à crianças, 0,2 mg/kg. Durante o período experimental o DON não causou sinais clínicos aparentes de intoxicação como recusa alimentar, redução no ganho de peso e anorexia. Estes achados têm sido relatados na literatura quando são utilizadas concentrações mais altas desta micotoxina. Os animais também não apresentaram sinais clínicos indicadores de alterações gastrointestinais, como diarreia. Entretanto, a ingestão de dieta contaminada com DON, em concentrações consideradas toleráveis, 0,2; 0,75; 1,75 e 2 mg/Kg, promoveu redução na área do corpo celular, dependente da dose, em neurônios HuC/D-IR, nNOS-IR, ChAT-IR, NADH-diaforase positivos e em gliócitos S100-IR do plexo mientérico; alterações morfométricas significativas na parede do jejuno, como redução na altura da parede total, túnica mucosa, altura das vilosidades e profundidade das criptas, redução no número de células caliciformes e aumento da atividade da mieloperoxidase, um indicador de estado inflamatório. Estes dados comprovam que o quadro clínico aparente de intoxicação não revela o real efeito da exposição à micotoxina. A avaliação da densidade de gliócitos mostrou que, a ingestão da dieta contaminada com DON não reduz o número destas células no plexo mientérico de ratos. Esta preservação glial numérica pode ser atribuída à resistência desta população celular e a um mecanismo de defesa exercido pela glia na tentativa de promover a manutenção dos neurônios que permanecem viáveis. Esta hipótese pode ser sustentada, pelo fato de a ingestão da dieta contaminada com DON, nas concentrações utilizadas, não ter promovido redução no número de neurônios entéricos. Em contrapartida, a avaliação do perfil de gliócitos e de neurônios entéricos, mostrou redução na área de tais células de maneira dependente da concentração de DON presente na dieta, o que refletiu em redução na área ganglionar. Isto se deve, provavelmente, ao fato de que esta micotoxina interfere na capacidade de síntese proteica e consequentemente, na atividade metabólica destas células. Nas concentrações utilizadas no presente trabalho, não houve alteração dos parâmetros oxidativos analisados. Trabalhos demonstrando que as alterações mitocondriais causadas pelo DON, podem alterar o estado oxidativo celular, foram realizados utilizando-se doses superiores às utilizadas em nosso trabalho. O DON geralmente penetra no organismo por via oral e subsequentemente atinge as células epiteliais intestinais, tendo um impacto significativo na integridade da barreira intestinal, o que pôde ser comprovado com a redução da altura da parede total, da túnica mucosa, das vilosidades, da profundidade das criptas e do número de células caliciformes verificadas neste trabalho. Verificou-se, por meio da avaliação da atividade da enzima mieloperoxidase, que a contaminação com 2 mg/Kg de DON também causa efeito inflamatório, pois houve aumento significativo da atividade da MPO e de acordo com a literatura danos causados pelo DON à integridade da parede intestinal podem permitir a passagem de antígenos e bactérias através das células epiteliais, gerando um efeito próinflamatório indireto. Entre os indicadores bioquímicos avaliados neste trabalho, somente alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (ALP) apresentaram alterações, o que está de acordo com a literatura que mostra que doses baixas desta micotoxina não promovem alterações em diversos parâmetros bioquímicos do sangue. No presente trabalho, houve redução nos níveis de ALT e ALP. De acordo com a literatura, estes dados apontam para processos patológicos no fígado no início da exposição à contaminação, com melhora adaptativa ao longo do consumo de dieta contaminada. As concentrações de DON no plasma refletem as concentrações de DON na dieta, porém, no decorrer de nossas análises, não foram observadas alterações quantitativas ou qualitativas nos elementos figurados do sangue. As células sanguíneas circulantes tendem a apresentar baixa sensibilidade à micotoxinas, sendo que, problemas hematológicos observados em casos de intoxicação, são devidos à mielotoxicidade e o DON apresenta baixa mielotoxicidade, o que justifica a sua baixa hematotoxicidade. Estes achados mostram que, mesmo na ausência de sinais clínicos aparentes de intoxicação, a exposição crônica ao DON tem efeitos negativos sobre gliócitos, neurônios e gânglios do plexo mientérico e causa alterações importantes no jejuno, o que poderia comprometer o funcionamento intestinal levando a redução da superfície absortiva e a defesa promovida pelas mucinas.

ABSTRACT: Deoxynivalenol (DON), a mycotoxin belonging to group B of trichothecenes, is produced mainly by fungi of the genus Fusarium. DON is commonly found, at high levels, in all the continents, contaminating cultures that are the basis of human feeding and also used to feed animals. The digestory system is the first and major target of DON, as its absorption takes place primarily in the jejunum. Once absorbed, DON rapidly reaches other organs, at decreasing order of concentration: liver, plasma, kidney, spleen, heart and brain. In this way, DON can cause gastrointestinal, hepatic, hematologic, renal, splenic, cardiac and neural effects. Despite DON affecting primarily the digestion system and possibly reaching the enteric nervous system (ENS), the study of its effects is limited to the Central Nervous System. The wide distribution and the high levels of contamination by DON have prompted many countries to regulate the maximal levels of contamination tolerable for grains (and their derivatives) for human and animal intake. Several studies have been showing the action of DON at doses higher than those considered tolerable for intake; however, the testing of high doses cannot always be used to predict the effects of low doses. The investigations of this thesis had the purpose of evaluating the effects of a diet contaminated with DON at concentrations within the maximum tolerable limit (MTL) for intake. In the first work, food ingestion, body weight, oxidative status and morphometric analyses of gliocytes and neurons of jejunal myenteric ganglia were recorded. Male Wistar rats aging 21 days were allotted to five groups that were given, for 42 days, diets contaminated with different concentrations of DON (0, 0.2, 0.75, 1.75 and 2 mg/kg of chow). In the second work, the morphologic characterization and the inflammatory status of the jejunum were assessed, as well as blood parameters. For this purpose, 24 male Wistar rats aging 21 days were distributed in three groups and treated for 42 days: a control group, a group given chow contaminated with DON at the lowest concentration within the MTL (0.2 mg/kg chow) and another group given chow contaminated with DON at a concentration close to the MTL (2 mg/kg chow). The lowest concentration is close to the levels of contamination with DON found in the literature for several countries, such as corn flour in Africa (0.294 mg/kg), in 95% of the samples of bread and cookies in China (0.1533 mg/kg) and in 83% of the wheat samples in Poland (0.1402 mg/kg). The concentrations are in accordance with the values established as maximal limits of contamination by some countries. The European Union established as maximal tolerable limit (MTL) of DON contamination for non-processed wheat 1.75 mg/kg; for non-processed cereals 1.25 mg/kg; for pasta and processed cereals 0.75 mg/kg; for child feeding 0.2 mg/kg. In Brazil, the current MTL of DON for nonprocessed wheat is 3 mg/kg, for processed cereals 1.25 mg/kg, for pasta and cookies 1 mg/kg and child feeding 0.2 mg/kg. During the experimental period, DON did not cause visible clinical signs of intoxication such as food rejection, decreased body weight gain and anorexia. These findings have been reported in the literature when higher concentrations of the mycotoxin are used. In this work, the animals did not present clinical signs indicative of gastrointestinal alterations, such as diarrhea. However, the ingestion of the DON-contaminated diet, at concentrations regarded as tolerable, 0.2, 0.75, 1.75 e 2 mg/Kg, promoted a dose-dependent decrease in the area of the cell bodies of HuC/D-IR, nNOS-IR, ChAT-IR and NADH-diaphorase positive neurons and in S100-IR gliocytes of the myenteric plexus of this intestinal segment; significant morphometric changes of the jejunal wall were recorded, such as decreased thickness of the wall and of the mucosa, decreased villus height and crypt depth, reduced number of caliciform cells and increased activity of myeloperoxidase (MPO), an indicator of inflammatory status. These data show that the visible clinical picture of intoxication does not reveal the true effect of the exposure to the mycotoxin. In this work, the evaluation of the density of gliocytes showed that the ingestion of the DONcontaminated diet did not decrease the number of these cells in the myenteric plexus of rats. This glial preservation can be attributed to the resistance of the cell population and to a mechanism of defense exerted by the glia in an attempt to promote the maintenance of the still viable neurons. This hypothesis can be reinforced by the fact that the DONcontaminated diet, at the concentrations tested, did not promote a decrease in the number of enteric neurons. On the other hand, the evaluation of the profile of gliocytes and enteric neurons showed a decreased area of these cells that was proportional to the concentration of DON in the chow, with the consequent reduction in ganglion area. Possibly this is due to the fact that this mycotoxin interferes with the capacity of protein synthesis and therefore with the metabolic activity of these cells. At the concentrations used in this work, the oxidative parameters analyzed were not changed. Investigations demonstrating that the mitochondrial changes caused by DON can alter the cell oxidative status were carried out using doses higher than those of this work. DON usually gains access to the organism through oral ingestion and then reaches the intestinal epithelial cells, where it has a significant impact on the integrity of the intestinal barrier, as indicated by the reduction in the thickness of the total wall and of the mucosa, in villus height, crypt depth and number of caliciform cells, recorded in this study. Through the activity of the enzyme MPO it was verified that the contamination with 2 mg/kg of DON also triggers an inflammatory effect, because there was a significant increase in MPO activity; according to the literature, injuries caused by DON on the intestinal wall may permit the passage of antigens and bacteria through the epithelial cells layer triggering an indirect pro-inflammatory effect. Among the biochemical markers assessed in this work, only alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (ALP) were decreased, in accordance with literature data showing that low doses of this mycotoxin do not change several blood biochemical parameters. According to other studies, the decreased ALT and ALP point to pathological processes in the liver at the start of the exposure, with an adaptive improvement during the intake of the contaminated diet. The plasma concentration of DON reflects its concentration in the diet; however, during our analyses, quantitative or qualitative changes of blood cells were not observed. Circulating blood cells tend to have low sensitivity to mycotoxins; hematologic alterations observed during instances of intoxication are due to myelotoxicity, which is low for DON, explaining its low hematotoxicity. These findings show that, even in the absence of evident clinical signs of intoxication, the chronic exposure to DON has negative effects on gliocytes, neurons and ganglia of the myenteric plexus and causes important jejunal alterations that may impair intestinal functioning, decreasing the absorptive surface and the defense promoted by mucines.