Ação de sistemas de efluxo na resistência à isoniazida em Mycobacterium tuberculosis

Abstract

RESUMO: A tuberculose (TB) pulmonar se mantém como uma ameaça global devido à alta transmissão e prevalência de humanos infectados por bacilos do complexo Mycobacterium tuberculosis. Características especificas da patogenia da doença e da estrutura do bacilo fazem com que o tratamento efetivo seja dificultado. Dentre elas, podemos citar: i) a presença de uma parede celular espessa e rica em lipídeos e ácidos micólicos; ii) a produção de enzimas hidrolíticas; iii) mutações aleatórias nos genes que codificam para os alvos dos fármacos; iv) e sistemas de efluxo capazes de reduzir a concentração intracelular de antimicrobianos. As bombas de efluxo (BEs) micobacterianas já são aceitas como mecanismos secundários de resistência a fármacos, mas ainda não há correlação entre efluxo e resistência à isoniazida (INH). Com o objetivo de estudar as BEs, pesquisadores vêm empregando moléculas com propriedades de inibidoras de bomba de efluxo (IBE). Verapamil (VP) é um dos fármacos mais utilizados com essa finalidade, uma vez que a redução da atividade de efluxo por ele exercida aumenta a suscetibilidade de M. tuberculosis a alguns medicamentos anti-TB. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel das BEs na resistência à INH, bem como o efeito combinatório de VP e INH em M. tuberculosis. Os resultados obtidos neste estudo estão apresentados no manuscrito "Efflux pump gene expression and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis". Primeiramente foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) e o efeito combinatório dos fármacos INH e VP, através dos métodos resazurin microtiter assay plate (REMA) e resazurin drugs combination microtiter assay (REDCA). Em posse desses resultados, quatro bacilos com diferentes perfis de resistência foram selecionados para ensaios de expressão gênica de BEs. Cada M. tuberculosis foi exposto separadamente a 0,5 x CIM de INH e INH+VP por 48 h. Por meio da RT-qPCR, foi determinada a expressão relativa de 10 genes que codificam para BEs em M. tuberculosis. Foi observada redução significativa da CIM de INH após combinação com VP para isolados suscetíveis aos fármacos anti-TB. Resumidamente, os ensaios de expressão gênica revelaram padrões de resposta contra a pressão de INH que se correlacionaram com cada perfil de resistência, presença ou ausência de mutações em genes de resistência e efeito combinatório com VP

ABSTRACT: Pulmonary tuberculosis (TB) remains a global threat due to the high transmission and prevalence of humans infected with bacilli of the Mycobacterium tuberculosis complex. Specific characteristics of the pathogenesis of the disease and the structure of the bacillus make effective treatment difficult. Among them, we can mention: i) the presence of a thick cell wall rich in lipids and mycolic acids; ii) the production of hydrolytic enzymes; iii) random mutations in the genes that code for drug targets; iv) and efflux systems capable of reducing the intracellular concentration of antimicrobials. Mycobacterial efflux pumps (EPs) are already accepted as secondary mechanisms of drug resistance, but we still lack strong correlation between efflux and resistance to isoniazid (INH). In order to study the EPs, researchers have been using molecules with properties of efflux pump inhibitors (EPI). Verapamil (VP) is one of the drugs most used for this purpose, since the reduction of the efflux activity exerted by it increases the susceptibility of M. tuberculosis to some anti-TB drugs. Thus, the objective of this study was to evaluate the role of EPs in resistance to INH, as well as the combinatorial effect of VP and INH in M. tuberculosis. The results obtained in this study are presented in the manuscript "Efflux pump gene expression and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis". First, the minimum inhibitory concentration (MIC) and the combinatorial effect of INH and VP were determined by resazurin microtiter assay plate (REMA) and resazurin drugs combination microtiter assay (REDCA) methods. With these results, four bacilli with different resistance profiles were selected for EPs gene expression assays. Each M. tuberculosis was exposed separately to 0.5 x MIC of INH and INH + VP for 48 h. Through RT-qPCR, the relative expression of 10 genes coding for EPs in M. tuberculosis was determined. Significant reduction of INH MIC was observed after combination with VP for isolates susceptible to anti-TB drugs. Briefly, gene expression assays revealed INH pressure response patterns that correlated with each resistance profile, presence or absence of mutations in resistance and combinatorial genes with VP