Biological properties of basidiomycetes isolated from Brazilian Atlantic Forest

Abstract

RESUMO: A oxidação é um processo vital aos organismos vivos para a geração de energia a partir dos combustíveis biológicos. Contudo, pode ser que ocorra o efeito denominado de estresse oxidativo, ou seja, a produção em excesso das espécies reativas do oxigênio (EROS) e outros radicais, afetando assim, a estrutura e a organização celular. O organismo possui mecanismos de proteção, todavia, um desequilíbrio na produção de EROS pode afetar as funções fisiológicas e resultar em doenças sérias, como por exemplo: câncer, artrite reumatóide, aterosclerose e processos degenerativos associados à idade. Estudos comprovam que os cogumelos, nome popular dado às frutificações de alguns tipos de fungos (das divisões Basidiomycota e Ascomycota), são capazes de produzir compostos antioxidantes, antimicrobianos e antitumorais. Sua eficácia está no fato de sintetizar diversos metabólitos secundários, tais como os compostos fenólicos, um grupo de substâncias distribuídas com abundância entre os vegetais e cogumelos, que participam do controle de algumas enfermidades devido ao seu poderio antioxidante. As duas formas, basidioma e micélio são amplamente estudados para usos na indústria alimentícia, inclusive no que diz respeito a alimento funcional, mas com relação às propriedades biológicas e à capacidade antioxidante do micélio, pouco tem sido descrito na literatura. Estima-se que o número de espécies de cogumelos é maior que 100.000 e que apenas 15-20% são conhecidas. Considerando o número de espécies descritas, são poucas as que ainda foram investigadas quanto ao seu conteúdo em metabólitos secundários, atividade antioxidante, antimicrobiana e demais propriedades, tais como citotoxicidade. No Brasil, existe em torno de 20.000 espécies de basidiomicetos, a maioria localizada em regiões tropicais e sub-tropicais. Devido às quantidades de biomas presentes neste país, é possível a realização de pesquisas na área de bioprospecção de novos microrganismos, em especial, os basidiomicetos. A Mata Atlântica brasileira é um dos biomas mais diversificados existente no planeta, sendo até mesmo reconhecida por possuir uma maior variedade por área do que a própria Floresta Amazônica. Estende-se de regiões tropicais a sub-tropicais e estima- se que sua fauna e flora correspondam de 1-8% do total de espécies mundiais, além disso, possuem uma enorme diversidade de microrganismos. Estudos indicam que os fungos exercem um papel essencial na conservação deste tipo de floresta. Desta forma este trabalho possui como natureza inovadora descrever a capacidade antioxidante, antimicrobiana e de citotoxicidade de alguns dos isolados de basidiomicetos. O micélio foi utilizado para obtenção dos extratos. Os fungos foram escolhidos de acordo com a escassez de relatos literários sobre os mesmos. No entanto, isolados de espécies de gêneros conhecidos (Pleurotus e Phellinus) foram também avaliadas para efeito de comparação. Foram avaliados oito isolados de basidiomicetos, gentilmente cedidos pela Embrapa Florestas (Colombo, PR, Brasil): Flaviporus venustus EF30, Hydnopolyporus fimbriatus EF41 e EF44, Inonotus splitgerberi EF46, Oudemansiella canarii EF72, Perenniporia sp. EF79, Phellinus linteus EF81 e Pleurotus albidus EF84. As bactérias e leveduras utilizadas foram cedidas pelo Departamento de Ciências Básicas da Saúde (DBS) da Universidade Estadual de Maringá (UEM) para os testes antimicrobianos. Ratos Wistar machos (~200 g) alimentados ad libitum com uma dieta padrão do laboratório (Nuvilab®, Colombo, Brazil) foram utilizados nos experimentos. Todos os experimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Maringá (CEUA/UEM) sob o protocolo nº 7669090317. As propriedades biológicas analisadas foram: capacidade antioxidante, atividade antimicrobiana e citotoxicidade, e cada uma delas foi avaliada por diferentes metodologias. As atividades antioxidantes foram determinadas pelos métodos do ABTS, TEAC, FRAP e ORAC; a antimicrobiana pela técnica de disco-difusão, CIM, CBM e CFM; enquanto que a avaliação da citotoxicidade foi pelos métodos de respiração mitocondrial e citotoxicidade em macrófagos peritoneais murinos. Todos os cogumelos apresentaram destaques, no entanto, H. fimbriatus e F. venustus foram os que apresentaram os melhores valores nos ensaios antioxidantes; F. venustus, P. linteus e P. albidus resultaram em atividade antimicrobiana; enquanto I. splitgerberi e P. albidus apresentaram resultados que comprovam suas citotoxicidades. Entre os oito basidiomicetos cujos micélios foram avaliados neste estudo, H. fimbriatus destacou-se com bons resultados em todos os testes de atividade antioxidante e citotoxicidade. Este fungo, conhecido por ser um destruidor de madeiras e produtor de celulases, já foi descrito na literatura por possuir atividade antimicrobiana, mas não atividade antioxidante e de citotoxicidade, como foi verificado neste estudo. Os dois isolados testados apresentaram diferenças de resultados com destaque para o isolado EF41 o que reforça a importância de estudos de bioprospecção. Os dados obtidos mostram que os micélios avaliados também podem ser uma importante fonte de antioxidantes. O cogumelo H. fimbriatus foi o que apresentou os resultados mais significativos nos testes antioxidantes. Três basidiomicetos apresentaram atividade antimicrobiana, indicando um potencial para novos estudos. Os resultados apresentados sugerem que I. spligerberi possui uma atividade desacopladora, mesmo na menor concentração testada, dissipando o gradiente eletroquímico mitocondrial. Por outro lado, P. albidus exerceu efeito somente sobre a atividade da succinato-oxidase não influenciando a eficiência respiratória mitocondrial. Portanto, ambos interferem negativamente na respiração mitocondrial, inferindo assim, suas citotoxicidades. A partir dos dados obtidos, pode-se ressaltar a importância de pesquisas de bioprospecção em biomas pouco explorados, como por exemplo, a Mata Atlântica.

ABSTRACT: Oxidation is a vital process for living organisms to generate energy from biological fuels. However, it may be that the so-called oxidative stress effect, that is, excess production of reactive oxygen species (ROS) and other radicals, thus affecting cell structure and organization. The organism has mechanisms of protection however an imbalance in the production of ROS can affect the physiological functions and result in serious diseases, such as cancer, rheumatoid arthritis, atherosclerosis and age-related degenerative processes. Studies have shown that mushrooms, a popular name given to the fruiting of some types of fungi (from the Basidiomycota and Ascomycota divisions), are capable of producing antioxidant, antimicrobial and antitumor compounds. Its efficacy is in the fact of producing several secondary metabolites, such as phenolic compounds, a group of substances distributed with abundance between vegetables and mushrooms that participate in the control of some diseases due to its antioxidant power. The two forms, basidioma and mycelium are widely studied for uses in the food industry, including with regard to functional food, but with respect to the biological properties and the antioxidant capacity of the mycelium, little has been described in the literature. It is estimated that the number of species of mushrooms is greater than 100,000 and that only 15-20% are known. Considering the number of species described, few are still investigated for their content in secondary metabolites, antioxidant activity, antimicrobial and other properties, such as cytotoxicity. In Brazil, there are around 20,000 species of basidiomycetes, most of them located in tropical and subtropical regions. Due to the quantities of biomes present in this country, it is possible to carry out research in the area of bioprospecting of new microorganisms, especially basidiomycetes. The Brazilian Atlantic Forest is one of the most diversified biomes on the planet, and is even recognized for having a greater variety by area than the Amazon Forest itself. It extends from tropical to subtropical regions and it is estimated that its fauna and flora correspond to 1-8% of the total world species, besides have an enormous diversity of microorganisms. Studies indicate that fungi play an essential role in the conservation of this type of forest. In this way, this work has the innovative nature to describe for the first time the antioxidant, antimicrobial and cytotoxicity capacity of some of the isolates of basidiomycetes. To obtain the extracts the mycelium was used. The fungi were chosen according to the scarcity of literary reports about them. However, isolates of species of known genera (Pleurotus and Phellinus) were also evaluated for comparison. Eight isolates of basidiomycetes, kindly provided by Embrapa Florestas (Colombo, PR, Brazil) were evaluated: Flaviporus venustus EF30, Hydnopolyporus fimbriatus EF41 and EF44, Inonotus splitgerberi EF46, Oudemansiella canarii EF72, Perenniporia sp. EF79, Phellinus linteus EF81 and Pleurotus albidus EF84. The bacteria and yeasts used were provided by the Department of basic Health Sciences (DBS) of the State University of Maringá (UEM) for the antimicrobial assay. Male Wistar rats (~200 g) fed ad libitum with a standard laboratory diet (Nuvilab®, Colombo, Brazil) were used in the experiments. All experiments were approved by the Committee on Ethics in the Use of Animals of the State University of Maringá (CEUA/UEM) under the protocol nº 7669090317. The biological properties analyzed were antioxidant capacity, antimicrobial activity and cytotoxicity, and each of them was evaluated by different methodologies. The antioxidant activities were analysed by ABTS, TEAC, FRAP and ORAC methods; the antimicrobial by the disc-diffusion technique, MIC, MBC and MFC; while evaluation of cytotoxicity was by mitochondrial respiration and cytotoxicity in murine peritoneal macrophages. All the mushrooms presented highlights, however, H. fimbriatus and F. venustus presented the best values in the antioxidant methods; F. venustus, P. linteus and P. albidus resulted in antimicrobial activity; while I. splitgerberi and P. albidus presented results that prove their cytotoxicity. Among the eight basidiomycetes whose mycelium were evaluated in this study, H. fimbriatus stood out with good results in all tests of antioxidant activity and cytotoxicity. This fungus, known to be a wood destroyer and producer of cellulases, has already been described in the literature as having antimicrobial activity, but not antioxidant activity and cytotoxicity, as were in this study. The two isolates tested showed differences of results with emphasis on the isolate EF41, which reinforces the importance of bioprospecting studies. The data obtained show that the mycelium evaluated can also be an important source of antioxidants. The H. fimbriatus was the one that presented the most significant results in the antioxidant assays. Three basidiomycetes presented antimicrobial activity, indicating a potential for further studies. The results presented suggest that I. spligerberi has a decoupling activity, even at the lowest concentration tested, dissipating the mitochondrial electrochemical gradient. On the other hand, P. albidus exerted only effect on succinate-oxidase activity without influencing mitochondrial respiratory efficiency. Therefore, both interfere negatively in mitochondrial respiration, thus inferring their cytotoxicities. From the data obtained, it is possible to emphasize the importance of bioprospecting research in little explored biomes, such as the Atlantic Forest.