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Authors: Santos, Fabiane Cristina dos, 1989-
Orientador: Barbosa-Tessmann, Ione Parra
Title: Produção, purificação e caracterização de uma endoglinase de Penicillium digitatum
Banca: Souza, Cristina Giatti Marques de
Banca: Kadowaki, Marina Kimiko
Keywords: Celulase;Penicillium digitatum;Endoglicanase;Hidrolase
Issue Date: 2014
Publisher: Universidade Estadual de Maringá
Citation: SANTOS, Fabiane Cristina dos. Produção, purificação e caracterização de uma endoglinase de Penicillium digitatum. 2014. 58 f. Dissertação (mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Estadual de Maringá, 2014, Maringá, PR. Disponível em: http://repositorio.uem.br:8080/jspui/handle/1/6132. Acesso em: 22 fev. 2021.
Abstract: RESUMIO: Introducao: O uso da tecnologia de hidrolise enzimatica vem apresentando grande destaque nos processos industriais, devido as suas caracteristicas positivas para o meio ambiente e economia mundial. As enzimas que promovem a catalise sao especificas e versateis, alem de atuarem em condicoes brandas de reacoes. Atualmente, as hidrolases utilizadas em bioprocessos sao derivadas de microrganismos, na sua maioria fungos. Devido a sua aplicabilidade biotecnologica, essas enzimas sao amplamente estudadas. Dentre elas destacam-se as celulases, as quais sao capazes de degradar a celulose em seus monomeros. Os principais e mais estudados produtores de celulases sao representados por fungos dos generos Trichoderma, Penicillium e Aspergillus. O complexo enzimatico da celulase e constituido por um grupo de tres enzimas (endoglicanases, exoglicanases e £]-glicosidases) que juntas atuam em sinergismo para a hidrolise completa da celulose, a qual e composta por unidades repetidas de D-glicose, unidas por ligacoes glicosidicas do tipo £]-1,4. O fungo Penicillium digitatum foi previamente isolado em nosso laboratorio como um produtor de atividade celulolitica, pois foi capaz de degradar a celulose presente no meio de cultivo como unica fonte de carbono. Nao ha relatos na literatura de estudos sobre a celulase de P. digitatum. Objetivos: Otimizar a producao da celulase do isolado de P. digitatum, assim como purificar e caracterizar a enzima. Metodos: Inicialmente, um meio de cultivo liquido descrito para a producao de celulases por fungos foi utilizado. A atividade enzimatica foi avaliada pela liberacao de acucares redutores do substrato utilizado. A cepa de P. digitatum foi cultivada em diferentes condicoes de temperatura, pH, agitacao e com diferentes fontes de carbono para determinar a melhor condicao de producao. Como o meio utilizado era rico em fontes organicas e inorganicas de nitrogenio, este meio foi subtraido destas fontes para avaliar o efeito na producao da enzima. A purificacao da enzima foi realizada pela precipitacao com 90% de saturacao com sulfato de amonio, dialise e cromatografia com Sephacryl S-200 HR. Uma analise de SDS-PAGE foi conduzida para confirmar a homogeneidade da amostra e para determinar a massa molecular. Uma analise de zimograma foi executada para confirmar a atividade de endoglicanase da enzima. O pH e a temperatura otimos, a estabilidade termica e dados cineticos foram obtidos com o ensaio enzimatico realizado em diferentes condicoes com a enzima purificada. Resultados e discussao: Os resultados obtidos mostraram que a cepa utilizada de P. digitatum produz uma atividade endoglicanasica pela degradacao da carboximetilcelulose (CMC). Lactose a 1% (m/v) no meio de cultura foi considerada a melhor fonte de carbono par a producao da endoglicanase por P. digitatum. O cultivo submerso estacionario, a 25 ¢XC, com o pH inicial do meio de cultivo de 5,0, foi a melhor condicao de producao da enzima. O pico de atividade enzimatica foi obtido apos cinco ou seis dias de cultivo com uma producao maxima de aproximadamente 180 U/mL de meio de cultura. A purificacao da enzima foi confirmada com SDS-PAGE. A enzima purificada tem uma massa molecular de aproximadamente 74 kDa e mostrou atividade sobre a CMC na analise de zimograma. A enzima foi inativada apos incubacao por duas horas em temperaturas acima de 60 ¢XC e apresentou uma T50 de 63,69 ¢XC nestas condicoes. A enzima apresentou temperatura otima de 60 ¢XC e pH otimo de 5,2. A constante de Michaelis-Menten (KM) da enzima para a CMC foi estimada ser de 8,12 mg/mL (0,812%, m/v) e a velocidade maxima (Vmax) de 1.250 ƒÝmol/mL.min¡V1 de acucares redutores liberados. Conclusoes: Uma endoglicanase com atividade especifica de 2.742 U/mg foi purificada de P. digitatum. A atuacao em pH 5,2 e a estabilidade termica ate 60 ¢XC torna a enzima estudada aplicavel para a sacarificacao da celulose nestas condicoes de pH e temperatura.
ABSTRACT: Introduction: The use of enzymatic hydrolysis technology has been presenting a big appeal in industrial processes due to their positive characteristics to the environment and world economy. Enzymes that promote the catalysis are specific and versatile, besides being able to act in mild reaction conditions. Nowadays, hydrolases used in bioprocesses are derived from microorganisms, in its majority fungus. Due to its biotechnological applicability, these enzymes are thoughtfully studied. Among them are the cellulases, which are able to degrade cellulose in its monomers. The main and more studied cellulases producers are the fungi of the genera Trichoderma, Penicillium, and Aspergillus. The cellulase enzymatic complex is composed by a group of three enzymes (endoglucanases, exoglucanases, and £]-glucosidases) that act together in synergism to the complete cellulose hydrolysis, which is composed by repetitive units of D-glucose linked by ƒÒ-1,4 glycosidic bond. The fungi Penicillium digitatum, was previously isolated in our laboratory as a producer of a considerable cellulolytic activity, because it was able to degrade the cellulose present in the culture media as the only carbon source. There is no report in the literature about the cellulose of P. digitatum. Objectives: Optimize the cellulose production from the isolate of P. digitatum, as well as to purify and characterize the produced enzyme. Methods: Initially, a liquid culture medium described for the production of cellulases was used. The enzymatic activity was evaluated by the release of reducing sugars from the used substrate. The strain of P. digitatum was cultivated in different conditions of temperature, pH, agitation, and with different carbon sources to determine the best production conditions. As the used medium was rich in organic and inorganic nitrogen sources, this media was subtracted from these sources to evaluate the effect in the enzyme production. The enzyme purification was performed by the precipitation with ammonium sulphate to 90% of saturation, dialysis, and column chromatography with Sephacryl S-200 HR. A SDS-PAGE analysis was conducted to confirm the purified enzyme homogeneity and to determine the molecular weight. A zymogram analysis was accomplished to confirm the enzyme endoglucanase activity. The thermal stability, the optimum temperature and pH, and the kinetic data were obtained with the enzymatic essay performed in different conditions with the purified enzyme. Results and discussion: The obtained results have shown that the used strain of P. digitatum produces an endoglucanase activity by the degradation of carboxymethylcellulose (CMC). Lactose 1% (w/v) in the culture medium was considered the best carbon source for the production of endoglucanase by P. digitatum. The submerse stationary culture, at 25 ¢XC, with the initial culture medium pH of 5.0, was the best condition for the enzyme production. The activity peak was obtained after five or six days of culture with a maximum production of approximately 180 U/mL of culture medium. The enzyme purification was confirmed by SDS-PAGE. The purified enzyme has a molecular mass of approximately 74 kDa and was active on CMC in the zymogram analysis. The enzyme was inactivated after two hours of incubation in temperatures above 60 ¢XC and presented a T50 of 63.69 ¢XC in these conditions. The enzyme presented an optimum temperature of 60 ¢XC and optimum pH of 5.2. The enzyme Michaelis-Menten constant (KM) for the CMC was estimated as 8.12 mg/mL (0.82%, w/v) and the maximum velocity (Vmax) was of 1,250 ƒÝmol/mL.min¡V1 of released reducing sugars. Conclusions: An endoglucanase with specific activity of 2,742 U/mg was purified from P. digitatum. Because the studied enzyme works in pH 5.2 and is thermo stable in temperatures up to 60 ¢XC, it is applicable to the cellulose saccharification in these conditions of pH and temperature.
Description: Orientador: Prof.ª Dr.ª Ione Parra Barbosa Tessmann
Dissertação (mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Estadual de Maringá, 2014
URI: http://repositorio.uem.br:8080/jspui/handle/1/6132
Appears in Collections:2.2 Dissertação - Ciências Biológicas (CCB)

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