Prospecção de bactérias rodutoras de enzimas hidrolíticas. Produção recombinante, purificação e caracterização de uma Ciclodextrinase de Massilia timonae

Abstract

RESUMIO: Introdução: Os processos industriais catalisados por enzimas são considerados importantes uma vez que atuam em condições brandas de temperatura e pressão, além de serem processos simples e apresentam menor impacto ambiental. A tecnologia de hidrólise enzimática movimenta uma soma considerável de recursos e vem apresentando grande destaque no mercado industrial. No mercado industrial as enzimas hidrolíticas são as mais empregadas e incluem amilases, celulases, lipases e proteases, entre outras. Elas são utilizadas em diversos ramos da indústria como na de alimentos, bebidas, papel, têxtil, produtos de limpeza, farmacêutica e até no tratamento de efluentes. Nestas indústrias a atual preferência é por enzimas de origem microbiana por causa de sua consistência, produção constante, estabilidade e grande capacidade catalítica. Embora as enzimas possam ser obtidas de diferentes microrganismos, ainda existe um desafio em se obter isolados que produzam enzimas hidrolíticas em grandes quantidades. Nesse sentido, a biologia molecular tem papel importante na produção e caracterização de enzimas recombinantes com potencial industrial. Objetivos: Devido à demanda comercial por biocatalisadores, a prospecção de novos microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas, juntamente com o desenvolvimento da biotecnologia enzimática, auxilia o meio científico-industrial na busca e no melhoramento de enzimas com características comerciais. Sendo assim, os objetivos desse trabalho foram o isolamento e a caracterização bioquímica de bactérias em grãos de milho apresentando sinais de podridão. Além da identificação molecular e avaliação de produção de enzimas hidrolíticas pelos isolados, técnicas de bioquímica e biologia molecular foram utilizadas para a clonagem, expressão recombinante, purificação e caracterização de uma ciclodextrinase de Massilia timonae. Materiais e Métodos: A bioprospecção foi realizada com grãos de milho usando a técnica de diluição seriada em água peptonada. A produção das enzimas amilase, celulase, lipase e protease foi verificada de modo qualitativo em meios seletivos. Isolados de bactérias obtidas em ágar nutriente foram transferidos para meios seletivos contendo amido, celulose microcristalina, óleo de oliva e leite desnatado. A formação de halo hidrolítico evidenciou os isolados produtores de enzimas e aqueles que produziram os maiores halos foram armazenados. Para a caracterização bioquímica, os isolados foram analisados com a coloração de Gram e cultura nos meio sólidos EMB (Eosina Methylene Blue), TSI (Triplice Sugar Iron), Agar Citrato de Simmons e SIM (Sulfide, Indole, Motility). Alguns isolados foram melhor analisados pelos testes de Vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP), além de fermentação individual de açúcares em meio líquido e cultura em meio sólido contendo ureia. A identificação molecular de 55 isolados foi feita pela amplificação parcial do rDNA 16S com iniciadores universais, seguido de sequenciamento e comparação com sequências depositadas em bancos de dados. Como há um número menor de espécies de bactérias descritas na literatura como produtoras de amilases, lipases e celulases, foi feito um teste de produção em meio líquido para alguns dos isolados produtores identificados. Um isolado de Pantoea dispersa e um de Massilia sp. foram identificados como produtores de lipase/esterase e amilase, respectivamente, o que é um dado novo para a literatura. Todo o gene 16S do isolado de Massilia sp. foi amplificado e sequenciado e uma análise de DNA barcoding revelou que era a espécie Massilia timonae. Uma pesquisa no genoma desta bactéria revelou a presença de cinco genes para amilases. Iniciadores foram desenhados para estes genes. Entretanto, apenas um deles foi amplificado por PCR com sucesso. Este gene que codifica uma ciclodextrinase (EC 3.2.1.54) foi clonado e sequenciado. Programas de bioinformática auxiliaram na análise in silico da estrutura da enzima. A expressão recombinante da proteína codificada foi otimizada em E. coli. A proteína expressa continha uma cauda de histidinas e foi purificada por afinidade em coluna de níquel. Após a purificação, SDS-PAGE e cromatografia por filtracao em gel foram usados para determinar a massa molecular da enzima produzida. Em adicao, a enzima recombinante foi caracterizada cineticamente e uma cromatografia em papel descendente foi realizada para avaliar os produtos de hidrolise. Resultados e Discussao: Na prospeccao de novos isolados produtores de enzimas hidroliticas foram armazenados 137 isolados, com predominancia de bacilos Gram negativos. A maior parte destes isolados eram produtores de celulase, seguidos de produtores de protease, lipase e amilase. Muitos apresentaram mais de uma atividade hidrolitica em meio solido. Os isolados foram agrupados segundo suas caracteristicas bioquimicas e isolados com caracteristicas bioquimicas unicas, diferenciados dos demais, e isolados representantes dos diferentes grupos bioquimicos obtidos foram selecionados para a identificacao molecular. Cinquenta e cinco isolados produtores de enzimas foram identificados molecularmente. Os produtores de proteases apresentaram maior diversidade de genero: Klebsiella, Pseudomonas, Ochrobactrum, Pantoea, Stenotrophomonas, Staphylococcus, Burkholderia, Sphingomonas, Isoptericola, Massilia e Bacillus. Isolados dos seguintes generos produziram amilases: Klebsiella e Massilia. Produtores de lipases tanto em meio solido como liquido pertenciam aos generos: Stenotrophomonas, Burkholderia, Klebsiella e Pantoea. Isolados dos generos Klebsiella, Enterobacter e Modestobacter produziram celulases. A analise de fermentacao submersa confirmou a producao de lipases e esterases por alguns isolados, entre eles o de P. dispersa, e de amilases por todos os isolados produtores, entre eles o de Massilia sp., mas nao foi evidenciada a producao de celulase pelos isolados testados. Com os resultados encontrados no primeiro trabalho, foi feita uma busca por sequencias codificadoras de amilases no genoma da M. timonae. Um gene de uma ciclodextrinase (EC 3.2.1.54) foi amplificado, clonado e sequenciado. Ciclodextrinases sao enzimas que participam do metabolismo do amido pelas bacterias hidrolisando ciclodextrinas. O gene clonado codificava uma proteina que continha todos os dominios estruturais de uma glicosil hidrolase da familia 13 (GH13). O meio ZYM-5052 de autoinducao foi considerado o melhor para a expressao da ciclodextrinase em Escherichia coli, comparado com o meio LB. Uma analise estrutural in silico da proteina expressa identificou sitios de ligacao do ion calcio, corroborando com os dados da literatura e os dados laboratoriais obtidos do papel essencial do calcio para a ativacao da enzima apos purificacao e para a estabilidade termica da enzima purificada (T50 = 48.45 ¢XC). A enzima purificada apresentou pH otimo de 7.0 e temperatura otima de 40 ¢XC, permanecendo estavel por 30 min de incubacao a 45 ¢XC. A analise de massa molecular por SDS-PAGE e cromatografia de exclusao em gel mostrou que a proteina purificada e um tetramero de 260 kDa com monomeros de 65 kDa. A enzima purificada foi fortemente inibida por ions metalicos como cobre, zinco, ferro e magnesio, e por EDTA. Os detergentes CTAB e SDS, cationico e anionico, respectivamente, inibiram completamente a enzima purificada, mas o detergente neutro Tween 80 nao foi um forte inibidor. A enzima purificada atuou preferencialmente sobre a ƒÒ-ciclodextrina e em bem menor proporcao sobre o amido e a maltodextrina. O KM para a £]-ciclodextrina foi de 2,1 mM, a Vmax da enzima purificada foi 0,084 £gmol/min, o kcat foi de 8326 min¡V1, e kcat/KM foi de 4,1 ¡Ñ 106 M¡V1min¡V1. A ciclodextrinase de M. timonae produziu glicose e maltose como produtos finais da hidrolise de £]-ciclodextrina, maltotetraose e maltoheptaose, mas nao hidrolisou a maltose. Conclusoes: Varios isolados de bacterias obtidas dos graos de milho foram identificados como produtores de enzimas hidroliticas. Algumas das especies encontradas nao tinham sido ainda descritas como produtoras ou suas enzimas ainda nao foram estudadas. O gene de uma nova ciclodextrinase de M. timonae foi clonado e expresso em E. coli. A enzima recombinante foi expressa em um alto nivel e apresentou caracteristicas enzimaticas que podem ser interessantes em aplicacoes industriais, como na hidrolise de oligossacarideos lineares.

ABSTRACT: Introduction: Industrial processes catalyzed by enzymes are considered important since they run under mild conditions of temperature and pressure, besides being simple and having lower environmental impact. Enzymatic hydrolysis technology has attracted a considerable amount of resources and has shown great prominence in the industrial market. In the industrial market the hydrolytic enzymes are the most employed and include amylases, cellulases, lipases, and proteases, among others. They are used in various industries such as food, beverage, pulp juice, paper, textiles, cleaning, pharmaceutical, and even effluent treatment. In these industries, the current preference is for enzymes of microbial origin because of its consistency, regular supply, stability, and greater catalytic activity. Although enzymes can be obtained from different microorganisms, there is still a challenge in obtaining isolates that produce hydrolytic enzymes in large amounts. In this sense, molecular biology plays an important role in the production and characterization of recombinant enzymes with industrial potential. Objectives: Due to the commercial demand for biocatalysts, the prospection of new microorganisms producing hydrolytic enzymes, together with the enzymatic biotechnology development, assists the scientific-industrial environment in the search and improvement of enzymes with commercial characteristics. Thus, the aims of this work were the isolation and biochemical characterization of bacteria from maize grains presenting rotten symptoms. In addition to the molecular identification and evaluation of the hydrolytic enzymes production by the isolates, biochemical and molecular biology techniques were used for the cloning, recombinant expression, purification, and biochemical characterization of a Massilia timonae cyclodextrinase. Materials and Methods: Bioprospecting was carried out with the maize grains, using the serial dilution technique in peptone water. The amylase, cellulase, lipase, and protease production was qualitatively verified in selective media. Bacteria isolates obtained in nutrient agar were transferred to selective media containing starch, microcrystalline cellulose, olive oil, and skimmed milk. The hydrolytic halo formation showed the enzyme-producing isolates and the ones with the largest halo were stored. For the biochemical characterization of these isolates, they were treated with Gram staining and culture in the solid media EMB (Eosin Methylene Blue), TSI (Triplice Sugar Iron), Simmons Agar Citrate, and SIM (Sulfide, Indole, Motility). Some isolates were better analyzed with the tests Methyl Red (RM) and Voges-Proskauer (VP), besides fermentation of single sugars in liquid medium as well as culture in solid medium containing urea. Molecular identification of 55 isolates was done by partial amplification of the 16S rDNA with universal primers, followed by sequencing and comparison with sequences deposited in databases. As there is a smaller number of species of bacteria described in the literature as producers of amylases, lipases, and cellulases, a test of production in liquid medium of these enzymes by some of the identified producing isolates was performed. An isolate of Pantoea dispersa and another of Massilia sp. were identified as lipase/esterase and amylase producers, respectively, what is a new data for the literature. The entire 16S gene from the Massilia sp. isolate was amplified and sequenced and a DNA barcoding analysis revealed that it was the species Massilia timonae. A survey on the genome of this bacterium revealed five genes coding for amylases. Primers were designed for these genes. However, only one of them has been successfully amplified by PCR. The gene that encoded a cyclodextrinase (EC 3.2.1.54) was cloned and sequenced. Bioinformatics programs aided in the in silico analysis of the enzyme structure. The recombinant expression of the encoded protein was optimized in E. coli. The expressed protein contained a histidine tag and was purified by affinity on a nickel column. After purification, SDS-PAGE and gel filtration chromatography were used to find the molecular mass of the produced enzyme. In addition, the recombinant enzyme was kinetically characterized and paper chromatography was performed to check the hydrolysis products. Results and Discussion: In the prospection of new isolates producing hydrolytic enzymes, 137 isolates were stored, with Gram-negative bacilli predominance. Most of these isolates were cellulase producers, followed by protease, lipase, and amylase producers. Many had more than one hydrolytic activity on a solid medium. The isolates were grouped according to their biochemical characteristics and bacteria isolates with unique biochemical characteristics, differentiated from the others, and isolated representatives of the different biochemical groups obtained were selected for molecular identification. Fifty-five enzyme-producing isolates were identified molecularly. Protease producers had the greater genera diversity: Klebsiella, Pseudomonas, Ochrobactrum, Pantoea, Stenotrophomonas, Staphylococcus, Burkholderia, Sphingomonas, Isoptericola, Massilia, and Bacillus. Isolates from the following genera produced amylases: Klebsiella and Massilia. Producers of lipases, identified in solid and liquid media, belonged to the genera: Stenotrophomonas, Burkholderia, Klebsiella, and Pantoea. Isolates of the genera Klebsiella, Enterobacter, and Modestobacter, have produced cellulases. The submersed fermentation analysis confirmed the lipases and esterases production by some isolates, including P. dispersa, and amylases by all the producer isolates, among them the Massilia sp. isolate, but cellulases were not produced. With the results found in the first work, a search was made for amylases coding sequences in the M. timonae genome. A cyclodextrinase gene (EC 3.2.1.54) was amplified, cloned and sequenced. Cyclodextrinases are enzymes that take part in the metabolism of starch by the bacteria hydrolyzing cyclodextrins. The cloned gene encoded a protein which contained all the structural domains of a family 13 glycosyl hydrolase (GH13). The auto induction ZYM-5052 medium was considered the best for the cyclodextrinase expression in Escherichia coli, compared to the LB medium. An in silico structural analysis of the expressed protein identified calcium ion binding sites, corroborating with the literature and the obtained laboratory data of the essential role of calcium for activation of the enzyme after purification and for thermal stability of the purified enzyme (T50 = 48.45 ¢XC). The purified enzyme presented optimum pH of 7.0 and optimum temperature of 40 ¢XC, remaining stable for 30 min of incubation at 45 ¢XC. The molecular weight analysis by SDS-PAGE and gel exclusion chromatography showed that the purified protein is a 260 kDa tetramer with 65 kDa monomers. The purified enzyme was strongly inhibited by metals ions such as copper, zinc, iron, and magnesium, and by EDTA. CTAB and SDS, cationic and anionic detergents, respectively, completely inhibited the purified enzyme, but the neutral detergent Tween 80 was not a strong inhibitor. The purified enzyme acted preferentially on ƒÒ-cyclodextrin and in a smaller proportion on starch and maltodextrin. The KM for the £]-cyclodextrin was of 2.1 mM, the Vmax of the purified enzyme was 0.084 £gmol/min, the kcat was 8326 min-1, and kcat/KM was 4.1 ¡Ñ 106 M-1min-1. The M. timonae cyclodextrinase released glucose and maltose as final products of the hydrolysis of £]-cyclodextrin, maltotetraose, and maltoheptaose, but did not hydrolyze maltose. Conclusions: Several isolates of bacteria obtained from the maize grains were identified as producers of hydrolytic enzymes. Some of the species found have not yet been described as producers or their enzymes have not yet been studied. The gene of a novel cyclodextrinase of M. timonae was cloned and was expressed in E. coli. The recombinant enzyme was expressed at a high level and presented enzymatic characteristics that may be interesting in industrial applications, as in the hydrolysis of linear oligosaccharides.