Expressão recombinante, purificação e caracterização de uma alfa-amilase de Massilia timonae

Abstract

RESUMO: Introdução: A?-amilase é uma hidrolase com grande demanda no mercado industrial de enzimas. Esta enzima é uma endoamilase, que libera dextrina e oligossacarídeos de vários comprimentos. As ?-amilases possuem três domínios, chamados A, B e C, no qual o primeiro possui uma estrutura tridimensional conservada (?/?)8e contém os resíduos catalíticos chave altamente conservados. O aumento crescente da demanda industrial de -amilases requer enzimas com diferentes características. O estudo com enzimas recombinantes é particularmente interessante, pois pode contribuir na descoberta de novas e melhores enzimas. Anteriormente em nosso laboratório, uma cepa de Massiliatimonae apresentando atividade amilolítica foi isolada de grãos de milho apresentando sinais de podridão. Objetivos: Clonar o gene que codifica uma ?-amilase de M. timonae, expressar a proteína em Escherichia coli, purificar e caracterizar a enzima recombinante expressa. Material e métodos: Com base na sequência do gene putativo de ?-amilase encontrado no genoma sequenciado e anotado de M.timonae e alinhamento com outras sequências similares, iniciadores foram desenhados para amplificar este gene por PCR a partir do DNA genômico de M.timonae. O gene amplificado foi primeiramente inserido no vetor pCR2.1®, o qual foi sequenciado e a sequência de aminoácidos foi obtida utilizando-se ferramentas de tradução. Estudos filogenéticos e modelagem por homologia foram conduzidos. O gene foi posteriormente subclonado no vetor de expressão pTrcHis2B. O vetor de expressão construído foi utilizado na transformação em E. coli Rosetta™(DE3). Após o crescimento bacteriano em meio Luria Bertani, as células foram coletadas por centrifugação, ressuspensas em tampão de lise e sonicadas. A amostra obtida foi centrifugada e a enzima foi purificada a partir do sobrenadante usando cromatografia de afinidade. A atividade da enzima recombinante purificada foi medida usando o método de descoloração do complexo amido-iodo. Para avaliar a pureza da enzima e a massa molecular, uma análise eletroforética foi conduzida. Uma avaliação da atividade usando zimograma também foi realizada. Os parâmetros cinéticos KM e Vmáxtambém foram encontrados. A especificidade do substrato foi avaliada utilizando amido, amilopectina, maltodextrina,?-ciclodextrina e 4-nitrofenil -D-glicopiranosídeo. Os produtos de hidrólise do amido foram avaliados por cromatografia descendente em papel e coloração com o método de nitrato de prata amoniacal. Os parâmetros pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica e estabilidade em diferentes pHs foram avaliados. Resultados e discussão: A proteína expressa tinha uma massa molecular de 46,7kDa.A estrutura modelada apresentou um monômero composto de três domínios, no qual o domínio A possui uma estrutura em barril (?/?)8 com os resíduos catalíticos conservados. A estrutura possui um pequeno domínio B irregular, com um pequeno domínio C composto de cinco fitas ? antiparalelas. A análise filogenética mostrou que a ?-amilase de M. timonae é relacionada com sequências de -amilases de bactérias e plantas. Uma maior especificidade foi encontrada para o amido, seguido da amilopectina e maltodextrina. Os valores encontrados para KMeVmáx foram 0,79 mg/mLe 0,04 mg/mL.min. Os açúcares glicose e maltose foram obtidos da hidrólise do amido pela enzima. O íon cálcio é requerido para a atividade enzimática, enquanto que EDTA, molibdênio, cobalto e mercúriomostraram fortes efeitos inibitórios. A enzima foi quase totalmente ativa na presença de SDS. A enzima exibiu temperatura e pH ótimos de 60 °C e 6,0, respectivamente. A Tm foi de 73,65 °C. Conclusão: Este trabalho reporta um sistema alternativo para a expressão recombinante de -amilase em E. coli e descreve uma nova -amilase bacteriana termofílica, termoestável e resistente a detergente aniônico, com uma alta identidade na sequência de aminoácidos com -amilases de outras bactérias e de plantas.

ABSTRACT: Introduction: The?-amylase is one hydrolase with great demand in the enzyme's industrial market. This enzyme is an endoamylase, which releases dextrin and oligosaccharides of various lengths. In general, ?-amylases have three domains, named A, B, and C, where the first has a conserved (?/?)8 three-dimensional structure and contains the highly conserved critical catalytic residues. The crescent increase in the industrial demand for -amylases requires enzymes with different characteristics.The study with recombinant enzymes is particularly interesting becauseit can contribute to the discovery of new and improved enzymes. Previously in our laboratory, a strain of Massiliatimonae showing amylolytic activity was isolated from maize grains presenting rotten symptoms. Objectives: To clone the gene encoding for an ?-amylase from M. timonae, express the recombinant protein in Escherichia coli, purify, and characterize the expressed enzyme. Material andmethods: Based on the putative ?-amylase gene sequence found in the sequenced and annotated genome of M. timonae, and alignment with other similar sequences, primers were designed to amplify this gene by PCR from the genomic DNA of M. timonae. The gene amplified was first inserted into the pCR2.1® vector, which was sequenced, and the amino acid sequence was obtained using translation tools. Phylogenetic studies and modeling by homology were conducted. The gene was further subcloned into the pTrcHis2B expression vector. The constructed expression vector was used in the transformation into the E. coli Rosetta™(DE3). After bacterial growth in Luria Bertani medium, the cells were harvested by centrifugation, resuspended in a lysis buffer, and sonicated. The sample obtained was centrifuged, and the enzyme was purified from the supernatant using affinity chromatography. The purified recombinant enzyme activity was measured using the starch-iodine complex distaining method. An electrophoretic analysis was performed to evaluate enzyme purity and molecular mass. An activity evaluation using a zymogram was also performed. The substrate specificity was evaluated using starch, amylopectin, maltodextrin, ?-cyclodextrin, and 4-nitrophenyl -D-glucopyranoside. The kinetics parameters KM and Vmax were also found. The starch hydrolysis products were evaluated by descending paper chromatography and staining with the ammoniacal silver nitrate method. The parameters optimapH and temperature, thermal stability, and stability in different pHs were evaluated. Results and discussion: The expressed protein had a molecular mass of 46.7kDa. The modeled structure showed to be a monomer composed of three domains, in which domain A had the (?/?)8-barrel structure with the conserved catalytic residues. The structure had a small irregular domain B, and a small domain C composed of five antiparallel ?-strands. The phylogenetic analysis showed that M. timonae ?-amylase is related to other bacterial and plant sequences. The KMand Vmax values were 0.79 mg/mLand 0.04mg/mL.min. Higher specificity was found towards starch, followed by amylopectin, and maltodextrin. Glucose and maltose were obtained from starch hydrolysis by the enzyme. The calcium ion is required for the enzyme activity, while EDTA, molybdenum, cobalt, and mercury showed strong inhibitory effects. The enzyme was almost entirely active in SDS presence. The enzyme exhibited optimal temperature and pH of 60 °C and 6.0, respectively. The Tmwas of 73.65 °C. Conclusion: This work reported an alternative E. coli system for -amylase recombinant expression and described a thermophilic, thermostable, and anionic detergent-resistant novel bacterial -amylase, with a high identity amino acid sequence to -amylases from other bacteria as well as with plants.