Estudos fisico-químicos da hipericina Encapsulada em Micelas copoliméricas do polaxâmero P-123 : aspectos fotofísicos e fotoinativantes sobre microorganismo

Abstract

A terapia fotodinâmica (TFD) tem se estabelecido como uma alternativa, aprovada por agências de saúde de diversos países, para o tratamento de varias doenças malignas e não malignas. A terapia fotodinâmica tem como princípio a excitação de um fotossensibilizador (FS) com luz visível na presença de oxigênio levando a formação de espécies citotóxicas (Espécies reativas de oxigênio, EROs) responsáveis pela inviabilização celular. A hipericina (Hip) é um fototossensibilizador natural extraído das plantas do gênero Hypericum perforatum ou obtida sinteticamente tendo como precursor o emodin. Diversos estudos in vivo e in vitro tem reportado sua atividade antiviral, antibacteriana e antitumoral. No entanto, a elevada hidrofobicidade da hipericina conferindo afinidade pelas membranas celulares e melhor eficácia terapêutica, torna-se um inconveniente para sua formulação e administração sistêmica. Com o objetivo de desenvolver uma formulação aquosolúvel para hipericina, preservando suas propriedades fotofisicas e fotodinâmicas, foi investigada a possibilidade da utilização de micelas copoliméricas de P-123 (Pluronic®), na formulação da hipericina. Os valores das constantes de ligação (Kb(Hip/P-123)) estimados em diferentes temperaturas revelaram aumento na interação da hipericina com a micela copolimérica de P-123 quando o processo de ligação ocorre em maiores temperaturas. Este comportamento foi melhor investigado, a nível molecular, utilizando uma metodologia adequada para estimativa dos parâmetros termodinâmicos de interação (?G°, ?H° e ?S°). Os valores de coeficiente de absorção molar e de rendimento quântico de fluorescência determinados para hipericina encapsulada na razão [Hip]/[P-123]mic igual a 1/6 mostraram-se similares ao reportado na literatura para hipericina solubilizada em solventes como etanol e DMSO, indicando a preservação das propriedades espectroscópicas da hipericina, quando em sua forma monomérica, após encapsulamento na micela copolimérica de P-123. A capacidade de solubilização (?) da hipericina na micela copolimérica de P-123 foi determinada, em regiões de baixa concentração de copolímero (0,25 - 0,0075%m/V), utilizando os espectros de emissão de fluorescência da hipericina formulada em diferentes razões [Hip]/[P-123]mic, e, portanto, considerando somente a forma monomérica da hipericina incorporada na micela copolimérica de P-123. Constatou-se que até a razão [Hip]/[P-123]mic igual a 8, as propriedades espectroscópicas (?598nm e ?F(Hip/P-123)) da hipericina mantiveram-se preservadas. O estudo de supressão de fluorescência da hipericina utilizando o iodeto (I-), supressor aquosolúvel, indicou a localização da hipericina no interior hidrofóbico da micela copolimérica. Este resultado converge com os estudos de abaixamento de temperatura das soluções Hip/P-123 e com os valores de tempo de vida de fluorescência da hipericina (?), onde foram observados comportamentos compatíveis com a localização da hipericina no core da micela copolimérica de P-123. Nos estudos de inativação fotodinâmica das formulações Hip/P-123 frente às bactérias S.aureus foi observado uma relação inversa entre a atividade fotodinâmica e a concentração de copolímero utilizada. Sendo este efeito atribuído a maior facilidade da hipericina particionar para a superfície bacteriana quando formulada em elevadas razões [Hip]/[P-123]mic e em baixa concentração de copolímero. Indicando que somente a preservação da geração de oxigênio singleto pelo fotossensibilizador (??1O2), quando incorporado em micelas copoliméricas, não é suficiente para inativação fotodinâmica da S.aureus. Portanto, foi possível desenvolver uma formulação aquosolúvel para a hipericina utilizando micelas copoliméricas de P-123, com suas propriedades fotofisicas e fotodinâmicas preservadas, tornando-a promissora para futuras aplicações em terapia fotodinâmica. As propriedades espectroscópicas das formulações Hip/P-123 mantiveram-se preservadas após processo de liofilização/reidratação, importante visando futuras aplicações comerciais

Photodynamic therapy (PDT) has been established as an interesting alternative for the treatment of various clinical trials and photodynamic inactivation of microorganisms (PDI), being approved by health agencies of several countries. Photodynamic therapy has as principle the excitation of a photosensitizer (PS) with visible light of specific wavelength in the presence of oxygen that leads to the formation of cytotoxic species (reactive oxygen species, ROS) and singlet oxygen, responsible for cell unviability. Hypericin (Hyp) is a natural photosensitizer extracted from plants of the genus Hypericumperforatum or obtained synthetically. Several studies in vivo and in vitro report the antiviral, antibacterial and antitumor activity. However, the high hydrophobicity of hypericin confer high affinity for biological membranes, resulting in an interesting therapeutic efficacy, but it hydrophobicity becomes a disadvantage in it formulation and systemic administration. Aiming to develop a formulation soluble in aqueous media of hypericin, preserving it photophysical and photodynamic properties, we investigated the formulation of this PS in P -123 copolymeric micelles (PluronicTM). The values of the binding constant (Kb(Hip/P-123)) were estimated at different temperatures, presenting an increase in the interaction of hypericin with the P -123 copolymeric micelle as a function of temperature increase. This behavior was better investigated at the molecular level, using a suitable methodology for estimation thermodynamic parameters of interaction (?G°, ?H° and ?S°). The values of molar absorption coefficient and fluorescence quantum yield determined for hypericin encapsulated in the ratio 1/6 [ Hip ]/[ P -123 ]mic, were similar to those reported in the literature for this compound solubilized in solvents such as ethanol and DMSO, indicating the maintenance of spectroscopic properties of hypericin encapsulated in P -123 copolymeric micelles in its monomeric form . The solubilizing capacity (?) of hypericin in the P -123 copolymeric micelle was determined in regions of low copolymer concentration (0,25 - 0,0075% w/v) utilizing the fluorescence emission spectra of hypericin in monomeric form formulated in different reasons [Hyp]/[P -123]mic. It was established that the ratio [Hyp]/[P- 123]mic equal 8, the spectroscopic properties (?598nm e ?F(Hip/P-123)) of hypericin remained preserved. The study of fluorescence quenching of hypericin using the iodide (I-) indicated the location of hypericin in the hydrophobic interior of the copolymeric micelle. This result converges with studies of thermal variation of Hyp/P-123 solutions and the values of the fluorescence lifetime of hypericin (?), where were observed consistent behaviors at the location of hypericin in the micelle core of copolymer P - 123. In studies of PDI using formulations Hip/P-123 against bacteria S. aureus was observed an inverse relation between photodynamic activity and copolymer concentration used. This effect is attributed to partition of hypericin in bacterial surface when formulated at high ratios [Hip]/[P-123]mic and low concentrations of copolymer. These results shown that only the maintenance of singlet oxygen generation by photosensitizer (??1O2) when incorporated into copolymeric micelles, is not sufficient to photodynamic inactivation of S. aureus. Therefore, it was possible to develop a formulation in aqueous media for hypericin in copolymeric micelles using P- 123, preserving its photophysical and photodynamic properties, making them promising for future applications in photodynamic therapy. The spectroscopic properties of the formulations Hyp/P-123 remained preserved after lyophilization/rehydration important feature aiming future commercial applications process