Micelas mistas de plurônicos P123/F127 como nanoplataforma para a encapsulação e entrega seletiva de fármacos hidrofóbicos em células tumorais

Abstract

O câncer é uma doença de rápido desenvolvimento sendo atualmente uma das maiores causas de morte no mundo. Como resultado, continuamente tem-se investido na busca por regimes de tratamentos e modalidades terapêuticas mais eficazes e seletivas. Neste contexto duas estratégias têm sido exploradas: (i) o uso da nanotecnologia para encapsular fármacos hidrofóbicas aumentando sua biodisponibilidade e ação antitumoral e (ii) a busca por diferentes fármacos e aplicações terapêuticas. Levando em conta estas duas estratégias no presente trabalho foi proposto o uso dos plurônicos P123 e F127, copolímeros tribloco que em soluções aquosas se auto-montam sinergicamente como micelas poliméricas mistas, a serem utilzadas como nanoplataforma para o encapsulamento e entrega de fármacos hidrofóbicos em células do câncer. Foram propostas diferentes fármacos e estratégias terapêuticas como o uso de derivados benzoporfirínicos para aplicação da terapia fotodinâmica (TFD), a combinação entre o agente fotodinâmico Verteporfina® e o quimioterapêutico Sorafenib® buscando efeitos sinérgicos e ainda a proposição da Niclosamida® como estratégia de reposicionamento para a terapia do câncer. No primeiro momento diversas proporções entre P123 e F127 foram avaliadas e a condição ótima obtida foi de P123/F127 na proporção 2:1 m/m (ou 4:1 em mol). As micelas apresentaram baixa concentração micelar crítica e distribuição de tamanho adequada. Nestas micelas foram encapsulados os fotossensibilizadores, derivados benzoporfirínicos, para aplicação da TFD. As micelas mistas de plurônicos P123/F127 promoveram eficiente encapsulação dos fotossensibilizadores investigados na forma monomérica, mantiveram suas propriedades fotofísicas favoráveis a TFD além de proporcionar elevada estabilidade cinética mesmo após diluições em água (1:50). Os ensaios de foto-atividade in vitro foram realizados nas linhagens celulares HeLa e A549 sob irradiação com luz vermelha e demonstraram elevada atividade citotóxica, especialmente em baixas concentrações das micelas. Assim, micelas mistas de P123/F127 demonstraram serem sistemas promissores como nanocarreador dos derivados benzoporfirínicos para a aplicação na TFD do câncer. Seguindo este raciocínio, o derivado benzoporfirínico Verteporfina® foi combinado com o agente antiangiogênico Sorafenib® buscando a ação antitumoral sinérgica. As micelas mistas de P123/F127 encapsularam ambos os fármacos de maneira efetiva, demonstraram ser estáveis em meios biorelevantes e forneceram diferentes perfis de liberação para os fármacos encapsulados. Por fim foi demonstrado que a presença do Sorafenib não alterou as propriedades fotofísicas da Verteporfina. Todas estas características estimularam estudos de citotoxicidade em células MDA-MB-231. Após 24 h de tratamento o Sorafenib encapsulado nas micelas foi mais ativo que o fármaco livre apenas em baixas concentrações. Já o regime de tratamento 24 + 24 h prolongou o efeito de citotoxicidade do Sorafenib encapsulado pelo bloqueio da fase S do ciclo celular. No entanto a terapia combinada apresentou menor citotoxicidade independentemente do regime de tratamento. Este comportamento se deve a menor captação celular das micelas e interferência pela possível co-localização dos fármacos a nível intracelular. Este resultado mostra que combinações entre fármacos necessitam de uma investigação detalhada sobre interações particulares e nenhum efeito sinérgico deve ser teorizado a priori. Buscando uma aplicação sítio-específica e teranóstica, micelas multifuncionais foram desenvolvidas. Para isto o plurônico F127 foi conjugado com a Biotina como agente de direcionamento ativo enquanto o plurônico P123 foi conjugado com a Rodamina B para imagem de fluorescência. Estas micelas multifuncionais foram utilizadas na entrega do fármaco Niclosamida® como uma estratégia para terapia de reposicionamento em carcinoma de pulmão de células não pequenas. A presença da Rodamina B na formulação permitiu determinar a localização intracelular das micelas e avaliar sua taxa de internalização. As micelas biotiniladas foram internalizadas mais eficientemente em células de câncer A549 do que em células fibroblastos normais NIH3T3, o que resultou em uma atividade antitumoral em células A549 de até 6 vezes maior para a Niclosamida encapsulada em relação ao fármaco livre. Posteriormente foi cultivada e desenvolvida a linhagem celular multirresistente A549-CPr. Também para esta linhagem celular houve maior efeito citotóxico para as micelas multifuncionais em relação ao fármaco livre sendo que não foi observada a formação de clones celulares após a interrupção do tratamento. Desta forma, o presente estudo apresentou o desenvolvimento de formulações a base de micelas mistas de plurônicos P123/F127 que se mostraram eficientes no encapsulamento de fármacos, estáveis sob diferentes condições e ainda servem como plataforma para a construção de um sistema nanoestruturado multifuncional atuando em aplicações teranósticas e que apresentam ação sítio-específica para células cancerígenas

Cancer is a disease of rapid development and is currently the one of the leading causes of death worldwide. As a result, more selective and efficient therapeutic modalities have been investigated. In this context two strategies have been explored: (i) the use of nanotechnology to encapsulate hydrophobic drugs increasing their bioavailability and antitumoral action and (ii) the search for different drugs and new therapeutic strategies. Therefore, in the present work it was proposed the use of pluronics P123 and F127, triblock copolymers in aqueous solutions is self-assemble synergistically as polymeric mixed micelles, to be used as nanoplatforms for the encapsulation and delivery of hydrophobic drugs to cancer cells. In addition, we proposed the use of different drugs and therapeutic strategies such as using benzoporphyrin derivatives for application of photodynamic therapy (PDT), the combination of the photodynamic agent Verteporfin® with the chemotherapeutic Sorafenib® to promote a synergistic anticancer effect and the proposition of Niclosamide® as repositioning strategy for cancer therapy. First, different proportions between pluronics P123/F127 were evaluated and the optimum condition was obtained for the ratio 2:1 w/w. These micelles showed low critical micelle concentration and suitable hydrodynamic diameter. At these micelles the photosensitizers benzoporphyn derivatives were encapsulated for PDT application. P123/F127 mixed micelles promoted an efficient encapsulation of the photosensitizers at the monomeric form, maintained their favorable photophysical properties and provided high kinetic stability in water solutions, even after dilution (1:50). The in vitro photodynamic assays were realized in HeLa and A549 cell lines under red light irradiation. The results demonstrated a high cytotoxic activity, especially at low micellar concentrations. Therefore, P123/F127 mixed micelles proved to be a promissing nanocarrier system to PDT application in cancer cells. Following this argument, the benzoporphyrin derivative Verteporfin® was combined with the antiangiogenic agent Sorafenib® aiming a synergistic antitumoral action. P123/F127 mixed micelles efficiently encapsulated both drugs, were stable even in biological relevant media and provided different drug release profiles. Finally, it was shown that the presence of Sorafenib did not alter the photophysical properties of verteporfin. All these characteristics stimulate further studies of formulation cytotoxicity in MDA-MB-231 cells. After 24 h of treatment, the encapsulated Sorafenib was more effective than the free drug, but only at low micellar concentrations. In addition, the treatment regimen 24 + 24 h extend the cytotoxicity effect of encapsulated Sorafenib by blocking the S phase of the cell cycle. However, the combined therapy presented lower cytotoxicity than the single treatment independently of the applied regimen. This behavior is due to the lower cellular uptake of micelles and possible interference by drug colocation at intracellular level. This result demonstrated that drugs combination need a detailed investigation about particular interactions and and no synergistic effect should be theorized a priori. Aiming the site-especific theranostic action, we developed multifunctional micelles based on Pluronic P123/F127. To this end, the vitamin Biotin was conjugatd to plurônic F127 to improve targeting ability and the dye Rhodamine B conjugated to P123 for fluorescence image. The multifunctional micelles were used to encapsulate the drug Niclosamide® as a repositioning therapy strategy to treat non-small lung cancer cells. The presence of Rhodamine B allowed to determine the intracellular localization of the formulation and to evaluate its internalization rate. The biotynilated micelles were internalized more efficiently in A549 cancer cells than in normal fibroblasts NHI3T3 cells, which resulted in a 6 times higher activity for encapsulated Niclosamide compared with free drug. After a multiresistant A549-CPr cell line was developed. Also to these cells we observed a higher antitumoral effect for Niclosamide encaspsulated in multufuncional P123/F27 mixed micelles comparing with free drug. In addition, no cell clones were observed even after stopping treatment. The present study showed the development of formulations based on pluronic P123/F127 mixed micelles that were efficient in encapsulating hydrophobic drugs, stable under different conditions and that serves as platform for the construction of a theranostic nanostructured multifunctional system to antitumoral site-specific action in cancer cells