Transformação genética de fungos endofíticos Diaporthe schini isolados de Vitis labrusca e atividade antagonística em patógenos

Abstract

A uva está entre as frutas mais consumidas no mundo, sendo a videira uma das mais antigas plantas cultivadas pelo homem. As doenças fúngicas causam muitos prejuízos na produção de uvas e exigem a utilização intensa de fungicidas químicos. Uma alternativa para minimizar a utilização de pesticidas e diminuir os impactos ambientais é a utilização de um controle integrado de doenças, como o uso de micro-organismos no controle biológico de patógenos. Os fungos endofíticos estabelecem uma íntima associação mutualística com os vegetais, colonizando o interior de seus órgãos e tecidos sem causar sintomas aparentes. Os endófitos são potencialmente úteis para a agricultura no controle biológico de doenças e pragas, isso se deve à sua capacidade de proteger a planta contra o ataque de herbívoros e fitopatógenos. O potencial biotecnológico dos endófitos tem estimulado pesquisas em relação aos mecanismos de interação endófito-hospedeiro. Um dos meios utilizados para o estudo dessa relação é a inserção de genes exógenos que produzem componentes celulares com emissão de fluorescência, permitindo a visualização direta dos micro-organismos sem a destruição das células. Muitos estudos têm demonstrado que a bactéria fitopatogênica Agrobacterium tumefaciens, frequentemente utilizada em procedimentos de transformação de plantas, é capaz de transferir parte do DNA (T-DNA) presente em seu plasmídeo Ti também para fungos. Endófitos de diversas espécies foram isolados de Vitis labrusca e apresentaram antagonismo in vitro frente a fitopatógenos da videira, dentre eles fungos do gênero Diaporthe. Este estudo teve por objetivos identificar em nível de espécie dois fungos endofíticos de videira pertencentes ao gênero Diaporthe, estabelecer uma metodologia de transformação genética para estes fungos mediada por A. tumefaciens, obtendo transformantes estáveis e rastreáveis no ambiente pela produção das proteínas fluorescentes verde e vermelha. Objetivou-se ainda a comparação da atividade antagonística em fungos patogênicos da videira dos transformados em relação à linhagem selvagem. As análises moleculares confirmaram a identidade dos dois fungos endofíticos como Diaporthe schini e foram obtidas altas frequências de transformação para estes fungos, 96 % com o plasmídeo pFAT-gfp para D. schini (B64-46) e 98 % com pCAMDsRed para D. schini (C27-07). Os transformantes mostraram-se resistentes à higromicina B e a presença do gene hph foi confirmada pela técnica de PCR. Eles também se apresentaram mitoticamente estáveis e expressando o fenótipo fluorescente, sendo que diferenças morfológicas nas colônias em relação às linhagens selvagens puderam ser notadas. Testes de antagonismo in vitro dos transformantes em fungos fitopatogênicos da videira não apresentaram variação na atividade antagonística em relação à linhagem selvagem. A transformação genética de D. schini mediada por A. tumefaciens demonstrou ser uma técnica eficiente na inserção aleatória de genes repórteres para o monitoramento da linhagem no ambiente

Grape is among the most consumed fruits in the world, and the grapevine is one of the oldest plants cultivated by man. Fungal diseases cause many losses in the grapes production and require intensive use of chemical fungicides. An alternative to minimize the use of pesticides and reduce the environmental impacts is the utilization of integrated control of diseases, as the biological control of pathogens by micoorganisms. Endophytic fungi establish an intimate mutualistic association with plants, colonizing the interior of yours organs and tissues without causing apparent symptoms. Endophytes are potentially useful for agriculture in the biological control of pests and diseases, this is due to its ability to protect the plant against the attack by herbivores and pathogens. The biotechnological potential of endophytes has stimulated researches on the mechanisms of endophyte-host interaction. One methodology used for the study this relationship is the insertion of exogenous genes that produce cellular components with fluorescence emission, allowing the direct visualization of microorganisms without destruction of the cells. Many studies have shown that the phytopathogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens, frequently used in plant transformation procedures, is able to transfer part of the DNA (T-DNA) present in its Ti plasmid for fungi. Endophytes of several species were isolated from Vitis labrusca and showed antagonism in vitro against phytopathogens of the grapevine, among them fungi of the genus Diaporthe. This study aimed to identify at species level two endophytes fungi of grapevine of the genus Diaporthe, establish a genetic transformation methodology for these fungi mediated by A. tumefaciens, getting transformants stable and traceable in the environment by production of green and red fluorescent proteins. Another objective is the comparison of antagonistic activity in pathogenic fungi of grapevine of the transformants in relation to the wild type. Molecular analyzes confirmed the identity of the two endophytic fungi as Diaporthe schini and high transformation frequencies were obtained, 96 % with the pFAT-gfp plasmid for D. schini (B64-46) and 98 % with pCAMDsRed for D. schini (C27-07). The transformants showed to be resistant to hygromycin B and the presence of the hph gene was confirmed by PCR. They also presented mitotically stable, expressing the fluorescent phenotype, with morphological differences in the colonies in relation to the wild types. In vitro antagonism tests of the transformants against phytopathogens fungi from grapevine demonstrated no variation in the antagonistic activity when compared to the wild type. Genetic transformation of D. schini mediated by A. tumefaciens proved to be an efficient technique for random insertion of reporter genes for monitoring the strain on the environment