Multiplex-PCR para pesquisa de Leishmania em Nyssomyia neivai (Pinto), espécie dominante nas ilhas do Rio Paraná, sul do Brasil

Abstract

RESUMO: As leishmanioses têm grande importância em saúde pública por se tratar de um complexo de doenças com diferentes formas clínicas e epidemiológicas, causadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitidos por fêmeas de flebotomíneos. A técnica da múltipla reação em cadeia da polimerase (multiplex-PCR) tem sido usada no diagnóstico da leishmaniose e para verificar as taxas de infecção natural de flebotomíneos por Leishmania spp. Assim, os objetivos deste estudo foram conhecer a fauna e o comportamento de flebotomíneos, e padronizar a multiplex-PCR para a detecção de Leishmania em flebotomíneo de ilhas do Rio Paraná, noroeste do estado do Paraná, Brasil. Os flebotomíneos foram coletados com armadilhas de Falcão, em dez ilhas: Bandeira, Carioca, Fina, Mutum, Japonesa, São José Catarino, Santa Rosa, Floresta, Chapéu Velho e Cruzeiro, de novembro de 2012 a novembro de 2014. Os flebotomíneos coletados foram identificados e armazenados em tubos com isopropanol, em pools de 10 fêmeas, para posterior extração do DNA. Os insetos foram macerados em um tampão de lise e a extração foi realizada com Chelex® 100 Resin. Dois pares de primers foram usados na multiplex-PCR. O primeiro par foi A1 e A2, que amplifica o fragmento de 120 pb da região conservada do minicirculo do kinetoplasto (kDNA) do gênero Leishmania. O segundo par de primers foi 5Llcac e 3Llcac que amplifica um fragmento de 220 pb da região do gene IVS6 da cacofonia em insetos do gênero Lutzomyia. Os produtos amplificados foram analisados em eletroforese de gel de agarose. Ny. neivai foi a única espécie coletada. Um total de 3.870 (387 pools) fêmeas de Ny. neivai foi submetido à multiplex-PCR. Os resultados da multiplex-PCR para detecção de Leishmania em flebotomíneos foram negativos. Portanto, a padronização da multiplex-PCR permitiu a determinação da taxa de infecção natural em flebotomíneos por Leishmania em uma única reação. Além disso, a multiplex-PCR pode ser usada quando há grande número de flebotomíneos a ser analisado, como nesta pesquisa. Apesar de não ter sido detectada a infecção natural de Ny. neivai por Leishmania, vale destacar que anteriormente, na ilha Mutum, este flebotomíneo foi detectado com infecção natural por Leishmania (Viannia), demonstrando a importância deste inseto na epidemiologia da leishmaniose cutânea

ABSTRACT: Leishmaniasis is of great importance in public health because it is a complex of diseases with different clinical and epidemiological forms, caused by protozoa of the genus Leishmania and transmitted by females of sandflies. Multiplex Polymerase chain reaction technique (multiplex PCR) has been used to the diagnosis of leishmaniasis and to verify the rates of natural infection of sandflies by Leishmania. Thus, the objectives of this study were to identify the fauna, the behavior of sandflies and standardization of the multiplex PCR reaction for the detection of Leishmania, in those insects in the islands of the Paraná River, Northwest of the state of Paraná, Brazil. Sandflies were collected with Falcão traps in ten islands: Bandeira, Carioca, Fina, Mutum, Japonesa, São José Catarino, Santa Rosa, Floresta, Chapéu Velho and Cruzeiro, from November 2012 to November 2014. Sandflies were attracted and placed in tubes with isopropanol, in pools of 10 females, for later extraction of the DNA. Insects were then added in a buffer, and the extraction was performed with Chelex® 100 Resin. Two pairs of primers were used in multiplex PCR. The first pair was A1 and A2, which amplify a fragment of 120 bp region the minicircle kinetoplast (kDNA) of the genus Leishmania. The second pair of primers was 5Llcac and 3Llcac, that amplify a fragment of 220 bp region the cacophony gene IVS6 in insects of the genus Lutzomyia. The amplified results were analysed in agarose gel electrophoresis. Ny. neivai the only species found. A total of 3,870 (387 pools) female of Ny. neivai was submitted to the multiplex PCR. The multiplex PCR results for Leishmania detection in sandflies were negative. The islands studied still preserve the native forest that favors the enzootic cycle of Leishmania. Therefore, the multiplex PCR was standardized, enabling determination of the infection rate of sandflies by members of the genus Leishmania in a single analysis, with certainty that the material analyzed is suitable for PCR. Moreover, the multiplex PCR is particularly useful when a large number of sandflies has to be analyzed, like in this research. Although no natural infection of Ny. neivai by Leishmania was found in this study, previously, on Mutum Island, Ny. neivai was detected with natural infection by Leishmania (Viannia), demonstrating the importance of this species in the epidemiology of cutaneous leishmaniasis