Estudos das propriedades físico-químicas da Hipericina encasulada em vesículas lipossomais unilamelares de DPPC visando aplicações em Terapia Fotodinâmica

Abstract

RESUMO: A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade clínica baseada na interação de um composto Fotossensibilizador (FS) com luz, de comprimento de onda adequado, em presença de oxigênio molecular (3O2), gerando espécies radicalares (EROS) e oxigênio singlete (1O2), responsáveis pela necrose e/ou apoptose celular, via transferência de energia. Esse tipo de tratamento vem sendo amplamente estudado devido à sua imensa gama de aplicação, que vai desde sistemas mais simples, como fungos e bactérias, até sistemas mais complexos, como os tumores malignos. A Hipericina (Hip) vem atraindo atenção como composto FS promissor para TFD, dado sua origem natural ou sintética, baixo fotobranqueamento e toxicidade. Sua elevada hidrofobicidade, torna necessário para aplicação in vivo, o uso de sistemas biotransportadores nanoestruturados os quais promovem uma maior solubilização e adicionalmente previnem a formação de espécies agregadas, inibitórias do processo fotossensibilização. Neste trabalho vesículas lipossomais unilamelares de DPPC foram utilizadas como sistemas carreadores de Hip, encapsulada via adição direta. Estudos envolvendo tamanho das partículas, revelaram um aumento do diâmetro médio das vesículas lipossomais com o processo de encapsulamento. A interação Hip/DPPC, mostrou-se maior com o aumento da temperatura (maiores valores de Kb), e possibilitou a determinação dos demais parâmetros de ativação do sistema (?G, ?H° e ?S°), que revelaram que além de espontâneo o processo de ligação Hip/DPPC é também endotérmico (?H°>0). A Eficiência de Encapsulamento (EE%) da formulação foi avaliada por meio da destruição das vesículas lipossomais com solvente orgânico, onde a Absortividade Molar (?) da Hip é conhecida, revelando uma EE% cerca de 17% maior a 50,0°C (74,3% e 89,3% a 30,0 e 50,0°C, respectivamente). Nos estudos de localização, não foi possível obter um valor de Ksv para temperaturas mais elevadas utilizando um supressor aquosolúvel, indicando uma maior penetração da Hip na bicamada lipídica, enquanto que a 30,0°C o valor de Ksv indicou a presença de duas populações acessíveis ao iodedo. Essa mudança de localização do FS com a temperatura foi confirmada com os estudos de Transferência de Energia Ressonante por Fluorescência (FRET), que indicaram distâncias de 29,7 e 36,7Å com relação ao DPH a 30,0 e 50,0°C, respectivamente. Como esperada, a incorporação da Hip nas vesículas lipossomais à 50,0°C, provocou um leve aumento no valor de ?F para 0,30, que teve por consequência uma proporcional diminuição no ??1O2 para 0,26, apresentando porém um significativo aumento no tempo de vida do oxigênio singlete (?), essencial ao tratamento com TFD. Adicionalmente, a formulação apresentou grande estabilidade térmica e temporal quando hidratada. No entanto, quando liofilizada/reidratada, houve destruição da estrutura/tamanho original das vesículas lipossomais. Os estudos atividade fotodinâmica foram realizados em células do tipo B16-F10 e em protozoários T. cruzi. Os resultados tornaram evidente a potencialidade da formulação desenvolvida, que apresentou valores de viabilidade celular e IC50 mesmo com baixas concentrações de fármaco (entre 3 a 5 ?mol L-1) bastante satisfatórios, apontando a Hip como uma forte candidata a FS para tratamentos com TFD

ABSTRACT: Photodynamic therapy (PDT) is a clinical modality based on the interaction of a photosensitizer compound (PS) with light of appropriate wavelength in the presence of molecular oxygen (3O2), generating radical species (ROS) and singlet oxygen (1O2) responsible for necrosis and/or apoptosis, through energy transfer. This type of treatment has been widely studied due to its vast range of application, ranging from simpler systems, like fungi and bacteria, to more complex systems as malignant tumors. Hypericine (Hyp) has been attracting attention as a promising compound for PS in PDT, given its natural or synthetic origin, low photobleaching and low toxicity. Its high hydrophobicity, required for in vivo application, the use of biocarriers nanostructured systems which promote a greater solubilization and further prevent the formation of aggregated species, that inhibit the photosensitization process. In this work, unilamellar liposomal vesicles of DPPC were used as carrier systems of Hip encapsulated through direct addition. Studies involving particle size, showed an increase in diameter of the liposome vesicles after the encapsulation process. The Hyp/DPPC interaction was higher with temperature increasing (higher Kb values) and allowed the determination of other system activation parameters (?G, ?H° and ?S°), which showed the spontaneity of the binding Hip / DPPC and also that process is endothermic (?H °> 0). The encapsulation efficiency (EE%) of the formulation has been evaluated through the destruction of the liposome vesicles with an organic solvent, where the molar absorptivity (?) of the Hyp is known, revealing an EE% about 17% higher at 50,0 °C (74,3% and 89,3% to 30,0 and 50,0 °C, respectively). In localization studies, it was not possible to obtain a KSV value in higher temperatures using a aquosolúvel quencher, indicating a higher penetration of the Hyp in the lipid bilayer, whereas the 30,0°C the KSV value indicated the presence of two accessible populations to iodedo. The changing in the PS location with temperature was confirmed with the Transfer Resonant Energy Fluorescence (FRET) studies, which indicated distances of 29,7 and 36,7Å regarding the DPH at 30,0 and 50,0°C respectively. As expected, the incorporation of Hyp in the liposomal vesicles at 50,0°C, caused a slight increase in ?F value to 0,30, which has resulted in a commensurate reduction in ?? 1O2 to 0,26, but showing a significant increase in lifetime of singlet oxygen (?), that is essential for treatment with PDT. Additionally, the formulation showed a high thermal stability and temporal when hydrated. However, after the freeze-drieyer/rehydrated, there destruction of the original structure/size of liposomal vesicles. The photodynamic activity studies were conducted on B16-F10 cells and protozoa Trypanosoma cruzi. The results become evident the formulation ability, which showed cell viability values and IC50 even with low drug concentrations (3 to 5 mmol L-1) quite satisfactory, indicating the Hyp as a strong candidate PS for treatments using PDT