Detecção, infecção latente e quantificação de Didymella bryoniae em melancia

Abstract

RESUMO: O fungo Didymella bryoniae é um importante patógeno na cultura da melancia (Citrullus lanatus) e outras cucurbitáceas, causando a doença conhecida como crestamento-gomoso-do-caule, além de outros sintomas como tombamento de plântulas, manchas foliares e podridão em frutos. D. bryoniae é transmitido via sementes infectadas, servindo como uma das formas potencialmente mais perigosas e silenciosas de dispersão global do patógeno e introdução em novas áreas. Há também indícios de ocorrência de infecção latente e infecção sistêmica na cultura da melancia, mecanismo já comprovado para outras cucurbitáceas. O crestamento-gomoso-do-caule é uma das principais doenças da cultura da melancia causando danos ao longo de todo o ciclo. Em condições de cultivo protegido o crestamento-gomoso-do-caule pode se tornar um grande problema devido à perpetuação do inóculo e modificações na expressão da doença em relação às condições de campo, com maior proporção de sintomas em caules em detrimento das folhas. Apesar da grande importância mundial desse patossistema, ainda há carência de estudos relacionados à cultura da melancia e ao cultivo de cucurbitáceas em ambiente protegido. Em função destas características, é importante a investigação da eficiência de métodos de detecção do patógeno em sementes, afim de garantir a qualidade de lotes de sementes e a criação de ferramentas de avaliação do crestamento-gomoso-do-caule para estas condições. Desta forma, este trabalho teve o objetivo de estudar a detecção, transmissão de D. bryoniae em plantas de melancia, avaliar a ocorrência de infecção latente e infecção sistêmica; e a criação de uma escala de avaliação do crestamento-gomoso-do-caule nas culturas da melancia e melão. O trabalho foi dividido em três capítulos: O Capítulo I teve o objetivo de comparar a eficiência de diferentes métodos de detecção D. bryoniae em sementes de seis cultivares de melancia. As sementes foram submetidas previamente a detecção molecular de D. bryoniae através de PCR multiplex. Na sequência foram comparados oito métodos de detecção do patógeno, compostos pelos testes de transmissão em substrato comercial e areia+solo; testes de transmissão em meio ágar-água e vermiculita expandida; e testes de sanidade de sementes em papel-filtro com sementes inteiras e divididas, e teste em meio BDA com sementes inteiras e divididas. Os resultados deste trabalho mostram que D. bryoniae está associado a sementes de melancia de diferentes origens e qualidades sanitárias, podendo servir como inóculo inicial para grandes epidemias. Os testes realizados em meio ágar-água e vermiculita expandida, e os testes realizados em substrato comercial e areia+solo foram capazes de detectar com melhor consistência a infecção por D. bryoniae de sementes dos híbridos de melancia. No Capítulo II foi verificada a ocorrência de infecção latente e sistêmica de D. bryoniae em plantas de diferentes cultivares de melancia, através de PCR multiplex utilizando oligonucleotideos específicos para o patógeno. Foram realizadas análises de PCR multiplex a partir do DNA extraído de plântulas de melancia assintomáticas aos 7, 21 e 40 dias após emergência. Adicionalmente foram realizadas análises de PCR multiplex em segmentos de caules localizados a 0 cm, 5 cm, 15 cm, 30 cm e 60 cm acima do tecido lesionado. Foi comprovada a existência de infecção latente do patógeno nas mudas assintomáticas em todos os cultivares analisados. Foi possível constatar infecção sistêmica em plantas adultas através da detecção do patógeno em segmentos de caule localizados até 60 cm acima do tecido lesionado. No Capítulo III o objetivo foi a proposição e validação de uma escala de avaliação do crestamento-gomoso-do-caule em caules de melancia e melão. Foram instalados cultivos de mini-melancia cv. 'Smile' e meloeiro-nobre cv. 'Sunrise' em cultivo protegido conduzidos sob diferentes sistemas de condução, visando obter a maior variabilidade de condições dentro deste ambiente. Foram realizadas avaliações da evolução dos sintomas nestas condições. Com base nas observações foi proposta uma escala de avaliação do crestamento-gomoso-do-caule em caules de cucurbitáceas. Foi possível correlacionar a área das lesões com o comprimento das lesões no caule através de regressão linear. A escala de avaliação apresentou precisão de 94,5% de atribuição correta de notas por avaliadores com o auxílio de fita métrica

ABSTRACT: Didymella bryoniae is one of the most important pathogens in watermelon crop and other Cucurbitaceae. It can cause cancers, dumping-off, leaf spots and fruit rot. Infected seeds may transmit D. bryoniae, acting as a silent and most potentially dangerous strategy of global dispersion of the pathogen and introduction into new areas. In addition, there are evidences of latent and systemic infection in watermelon crop, a verified mechanism for other cucurbits. Gummy-stem-blight is one of the major diseases of watermelon (Citrullus lanatus), causing damage throughout the crop cycle. Under protected environment, gummy-stem-blight can become a major problem due to the inoculum perpetuation and changes in disease epidemiology when compared with field conditions, with more stem symptoms despite of leaf symptoms. Despite the great importance of this pathosystem worldwide, there is still a lack of studies related to the watermelon crop in protected environment. Due to these features, it is important to verify the efficiency of detection methods in checking the quality of seed lots. In addition, the epidemiological study and development of tools for disease measurement for these conditions. Therefore, this work had the objective of studying the detection and transmission of D. bryoniae in watermelon plants and develop tool for quantification of the Gummy-stem-blight severity in protected environment in watermelon and melon crops. The work was divided in three chapters: In Chapter I, was compared the efficiency of different detection methods of D. bryoniae in seeds of six watermelon cultivars. Previously, seeds were submitted to molecular detection of D. bryoniae by multiplex PCR. Eight detection tests were performed: two transmission tests on commercial substrate and sand + soil; two transmission tests in agar-water medium and expanded vermiculite; And seed sanity tests on filter-paper with divided and undivided seeds, and BDA medium tests with divided and undivided seeds. The results of this work show that D. bryoniae is associated with watermelon seeds of different origins and sanitary qualities, and infested seeds can serve as initial inoculum for large epidemics. The tests on agar-water medium and expanded vermiculite and the tests on commercial substrate and sand + soil detected the seed infection by D. bryoniae with better consistency than the other tests. In Chapter II, was verified the existence of latent and systemic infection of D. bryoniae in different cultivar of watermelon plants through multiplex PCR using previously developed pathogen-specific oligonucleotides. Multiplex PCR tests were performed on DNA extracted from asymptomatic watermelon seedlings at 7, 21 and 40 days after emergence. In addition, multiplex PCR tests were performed in stem segments located at 0 cm, 5 cm, 15 cm, 30 cm and 60 cm above the injured tissue. The results confirmed the latent infection of the pathogen in asymptomatic seedlings in all cultivars analyzed. It was possible to identify systemic infection in adult plants by detecting the pathogen in stem segments located up to 60 cm above the injured tissue. In Chapter III, the objective was to evaluate the symptomatology of the gummy-stem-blight on mini-watermelon and muskmelon stems grown protected environment and the suggestion of a disease scale to evaluation of the disease in cucurbit stems. Mini-watermelon "Smile" and muskmelon "Sunrise" were established in protected environment under different breeding systems, to achieve the greatest variety of conditions within this environment. Were measured the symptoms evolution under these conditions. Based on the results, it was suggested a disease assessment scale of gummy-stem-blight in cucurbit stems. It was possible to correlate the area of stem lesions with their length through linear regression. The disease scale presented accuracy of 94.5% of correct assignment of scores by evaluators when aided by a tape measure