Avaliação dos tratamentos com curcumina e nanopartículas de resveratrol na injúria promovida pela isquemia e reperfusão intestinal

Abstract

RESUMO:A isquemia e reperfusão (IR) intestinal é causada por uma variedade de eventos clínicos, dentre eles embolia, hérnia, infecção, cirurgias abdominais e transplante do intestino delgado. Acidentes automobilísticos e doenças crônicas como por exemplo, a doença de Crohn e retocolite, também são responsáveis por episódios de isquemia. A incidência de morte é alta para esses pacientes, particularmente para aqueles em estado crítico, onde o risco de mortalidade está entre 60 e 80% dos casos. O trato gastrintestinal é extremamente sensível a IR e a injúria causada ao intestino afeta principalmente a mucosa e o sistema nervoso entérico. A motilidade e a secreção intestinal são altamente dependentes da atividade de neurônios entéricos e a perda destes neurônios pode resultar em disfunção intestinal. Essas alterações intestinais podem ser justificadas pelos eventos simultâneos que ocorrem durante a fase de isquemia seguida da fase de reperfusão. Durante a isquemia, ocorre lesão da mucosa intestinal e aumento da permeabilidade microvascular. Em nível celular ocorre a depleção de adenosina trifosfato (ATP) que leva ao acúmulo de hipoxantina, o substrato da xantina oxidase. Ao iniciar a fase de reperfusão, e com a reentrada de moléculas de oxigênio, a hipoxantina é convertida em xantina pela xantina oxidase com consequente produção do radical livre superóxido. A partir dessa espécie reativa, várias outras espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser formadas. Além de EROs, também se formam espécies reativas de nitrogênio que são capazes de causar danos celulares e teciduais. Portanto, os radicais livres formados são um dos principais produtos da injúria causada pela isquemia seguida de reperfusão. A partir desse momento, ocorrem várias outras alterações intestinais, como inflamação, edema celular, desequilíbrio de transporte de íons, desorganização do citoesqueleto e prejuízo a microcirculação. Em consequência disso, o tecido afetado pode sofrer a morte celular por necrose e/ou apoptose. Contudo, os insultos não são limitados apenas ao intestino. A IR intestinal também promove a lesão das células epiteliais que afeta negativamente a integridade mucosa, levando a um aumento da permeabilidade epitelial intestinal. Vários estudos tem sugerido que a injúria na mucosa intestinal permite a translocação de bactérias e endotoxinas do lúmen intestinal para a circulação sanguínea sistêmica, o que pode causar o desenvolvimento de lesões a outros órgãos. As consequências que a IR intestinal podem causar nesses órgãos, ainda não são totalmente compreendidas. Em geral, sabe-se que a injúria por IR intestinal associada à translocação bacteriana pode acarretar e/ou promover estresse oxidativo e inflamação sistêmica. Assim sendo, o estresse oxidativo desempenha importante papel na lesão de IR intestinal e, substâncias que podem eliminar radicais livres, como os antioxidantes, seriam alternativas terapêuticas promissoras para o tratamento da injúria por isquemia e reperfusão intestinal. Vários autores têm relatado que a curcumina e o resveratrol possuem grande potencial terapêutico, incluindo atividade antioxidante e anti-inflamatória. A curcumina [diferuloylmethane, 1, 7-bis(4-hydroxy-3-methoxiphenyl)-1, 6-heptadiene-3,5-dione)] é um componente laranja-amarelo derivado do açafrão (Curcuma longa) e alguns estudos em modelos experimentais de injúria por IR intestinal tem demonstrado efeitos benéficos quanto a sua aplicação no próprio intestino. Entretanto, ainda são limitados os estudos quanto aos efeitos da curcumina em órgãos distantes que são afetados pela isquemia e reperfusão intestinal. Neste contexto, e devido à importância das consequências clínicas que a isquemia e reperfusão intestinal podem provocar, avaliamos os efeitos do tratamento com curcumina sob os parâmetros de estresse oxidativo e de mieloperoxidase no fígado e nos rins de ratos submetidos à 45 minutos de isquemia intestinal seguida de 7 dias de reperfusão. Trinta animais foram utilizados nesse experimento (n = 6 / grupo). O animais foram tratados com 60 mg/kg de peso corporal de curcumina na forma livre através de gavagem. O tratamento teve inicio 5 dias antes da cirurgia e foi realizado diariamente por 7 dias depois (período de reperfusão). O sangue foi coletado, centrifugado e submetido às técnicas de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST). O fígado e os rins foram coletados, pesados e submetidos às técnicas de mieloperoxidase e de estresse oxidativo. Como resultado pudemos verificar que a IR intestinal afetou principalmente o fígado, promovendo inflamação e estresse oxidativo. Provavelmente, os rins admitem reparos muito mais cedo que o fígado, uma vez que após 7 dias de reperfusão já não apresentaram alterações na mieloperoxidase e nos principais parâmetros de estresse oxidativo. Apesar do tratamento com a curcumina ter desempenhado efeitos benéficos, amenizando ou até mesmo impedindo a injúria por IR intestinal nos rins e principalmente no fígado dos animais, a literatura tem relatado que uma das maiores dificuldades na administração oral de substâncias potencialmente terapêuticas é o tempo de meia vida curto por ser rapidamente metabolizado e a baixa absorção, com consequente necessidade de utilização de alta dosagem. A utilização de sistemas de liberação modificada de fármacos torna-se uma ferramenta útil para melhorar a biodisponibilidade da substância de interesse tornando o tratamento mais eficiente. Estudos prévios relataram que o tratamento oral com 10 mg / kg de resveratrol (3,5,4'-trihidroxi-estilbeno) na forma livre é capaz de amenizar os danos causados pela IR intestinal, no entanto, estes efeitos benéficos não são completamente eficientes. O uso de sistemas nanoparticulados capazes de aumentar a biodisponibilidade do resveratrol poderia ser uma alternativa mais eficiente para o tratamento da IR intestinal. Sistemas nanoparticulados com alta capacidade bioadesiva, como o poli(anidrido) [Poli(anidrico metil vinil éter-co-maleico) ou poli(anidrido) (Gantrez® AN 119)], poderiam ser ótimos carreadores que atingiriam a região afetada pela IR. O desenvolvimento de interações adesivas entre sistemas nanoparticulados e a mucosa intestinal induz esse dispositivo à entrega deste fármaco através do contato íntimo com a membrana de absorção. Por ser eficaz no aumento da permanência no epitélio intestinal e no aumento da biodisponibilidade do fármaco, investigamos se nanopartículas de poli(anidrido) carregadas com resveratrol, na dosagem de 7 mg / kg de peso corporal, poderia promover redução do estresse oxidativo na parede intestinal e neuroproteção mientérica através dos efeitos benéficos do resveratrol no íleo de ratos submetidos à 45 minutos de isquemia seguido de 7 dias de reperfusão. Para isso, nanopartículas de poli (anidrido) contendo resveratrol foram sintetizadas e passaram por avaliações físico-químicas. Para realização do experimento, 54 ratos Wistar foram divididos em nove grupos (n = 6 / grupo) e foram tratados a cada 48 horas, tendo início 5 dias antes da cirurgia e mantendo o tratamento por 7 dias depois (período de reperfusão), por meio de gavagem com 7 mg/kg de peso corporal de resveratrol (na forma livre ou nano encapsulado). A artéria mesentérica superior foi ocluída por 45 minutos para causar lesão de IR. Foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo, mieloperoxidase, nitrito, aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, imunomarcação de neurônios mientéricos e células gliais entéricas e a velocidade do trânsito gastrintestinal. As avaliações físico-químicas mostraram que ambas as formulações de nanopartículas (com resveratrol e vazias) apresentaram carga negativa com distribuição homogênea, e a carga útil apresentou uma eficiência de encapsulação de 60%. A IR promoveu estresse oxidativo, perda neuronal mientérica da população geral, aumento do perfil neuronal da subpopulação nitrérgica e das varicosidades vipérgicas, proliferação glial (S100-IR), gliose reativa (GFAP-IR) e lentidão no tempo do trânsito gastrintestinal. O tratamento com resveratrol administrado na forma livre impediu as alterações causadas pela IR. Os resultados dos grupos tratados com nanopartículas carregadas com resveratrol apresentaram resultados semelhantes ao grupo tratado com resveratrol livre. Os animais tratados com nanopartículas vazias (sem resveratrol) apresentaram hepatotoxicidade. É importante ressaltar que alguns autores que trabalharam com nanopartículas de poli(anidrido) afirmaram não encontrar evidências de que elas possam ser absorvidas pelo epitélio intestinal, desempenhando apenas papel de bioadesão e biodisponibilidade do fármaco encapsulado. Provavelmente o modelo experimental empregado (45 minutos de isquemia seguida de 7 dias de reperfusão), promoveu a ruptura da barreira epitelial, causando a translocação das nanopartículas, podendo justificar a hepatotoxicidade encontrada. Além disso, encontramos algumas alterações negativas no grupo sham tratado com as nanopartículas vazias, indicando toxicidade no tecido intestinal. Provavelmente o resveratrol presente nas nanopartículas carregadas, protegeu os tecidos dos animais tratados com essa formulação. Concluímos que o tratamento com nanopartículas vazias mostrou que o poli (anidrido) não é um nanocarreador ideal para aplicação em modelos in vivo de lesão intestinal de IR, devido principalmente à hepatotoxicidade que pode ser causada por disfunção da barreira epitelial que desencadeia a translocação de nanopartículas. Tanto as alterações de hepatotoxicidade encontradas utilizando as técnicas de AST e ALT, como as alterações de estresse oxidativo observadas principalmente no fígado, indicam fortemente que a injúria por IR intestinal afeta outros órgãos além do próprio intestino, alertando para a importância de estudos mais aprofundados dessa patologia. Observamos que a curcumina e o resveratrol são substâncias terapêuticas promissoras para aplicação clínica, porém são necessárias adaptações farmacêuticas para melhorar a eficácia dessas substâncias através de uma liberação direcionada e diminuição na dosagem. Por fim, os resultados demonstraram que, apesar da importância das inovações terapêuticas, nem todos os materiais poliméricos aplicados como nanocarreadores podem ser considerados seguros para a saúde humana e devem ser cuidadosamente avaliados antes de chegar à fase de ensaios clínicos

ABSTRACT: Intestinal ischemia and reperfusion (RI) is caused by a variety of clinical events, including embolism, hernia, infection, abdominal surgeries, and small bowel transplantation. Auto accidents and chronic diseases such as Crohn's disease and rectocolitis are also responsible for episodes of ischemia. The incidence of death is high for these patients, particularly for those in critical condition, where the risk of mortality is between 60 and 80% of the cases. The gastrointestinal tract is extremely sensitive to IR and the injury to the intestine mainly affects the mucosa and enteric nervous system. Motility and intestinal secretion are highly dependent on the activity of enteric neurons and the loss of these neurons can result in intestinal dysfunction. These intestinal changes can be justified by the simultaneous events that occur during the ischemia phase followed by the reperfusion phase. During ischemia, intestinal mucosal lesion and increased microvascular permeability occur. At the cellular level occurs the depletion of adenosine triphosphate (ATP) that leads to the accumulation of hypoxanthine, the substrate of xanthine oxidase. When initiating the reperfusion phase, and with the reentry of oxygen molecules, hypoxanthine is converted into xanthine by xanthine oxidase and consequently the superoxide free radical is produced. From this reactive species, several other reactive oxygen species (ROS) can be formed. In addition to ROS, reactive nitrogen species are also formed that are capable of causing cellular and tissue damage. Therefore, formed free radicals are one of the main products of the injury caused by ischemia followed by reperfusion. From this moment on, several other intestinal changes occur, such as inflammation, cellular edema, imbalance of ion transport, disorganization of the cytoskeleton and impairment of microcirculation. As a consequence, the affected tissue can undergo cell death by necrosis and / or apoptosis. However, insults are not limited only to the gut. Intestinal IR also promotes epithelial cell injury that negatively affects mucosal integrity, leading to increased intestinal epithelial permeability. Several studies have suggested that injury to the intestinal mucosa allows the translocation of bacteria and endotoxins from the intestinal lumen into the systemic blood circulation, which can cause the development of lesions in other organs. The consequences that intestinal IR can cause in these organs are not yet fully understood. In general, it is known that intestinal IR injury associated with bacterial translocation can lead to and / or promote oxidative stress and systemic inflammation. Thus, oxidative stress plays an important role in intestinal IR injury, and substances that can eliminate free radicals, such as antioxidants, would be promising therapeutic alternatives for the treatment of intestinal ischemia and reperfusion injury. Several authors have reported that curcumin and resveratrol have great therapeutic potential, including antioxidant and anti-inflammatory activity. Curcumin [diferuloylmethane, 1, 7-bis (4-hydroxy-3-methoxiphenyl) -1,6-heptadiene-3,5-dione)] is an orange-yellow component derived from turmeric (Curcuma longa) and some studies in experimental models of intestinal IR injury have shown beneficial effects in their application to the intestine itself. However, studies on the effects of curcumin on remote organs that are affected by intestinal ischemia and reperfusion are still limited. In this context, and due to the importance of the clinical consequences that intestinal ischemia and reperfusion can cause, we evaluated the effects of curcumin treatment under the parameters of oxidative stress and myeloperoxidase in the liver and kidneys submitted to 45 minutes of intestinal ischemia followed of 7 days of reperfusion. 30 animals were used in this experiment (n = 6 / group). The animals were treated with 60 mg / kg body weight of curcumin in free form through gavage. Treatment started 5 days before surgery and was performed daily for 7 days after (reperfusion period). Blood was collected, centrifuged and submitted to alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) techniques. The liver and kidneys were collected, weighed and submitted to myeloperoxidase and oxidative stress techniques. As a result we could verify that intestinal IR affected mainly the liver, promoting inflammation and oxidative stress. Probably, the kidneys admit repairs much earlier than the liver, since after 7 days of reperfusion they no longer presented alterations in the myeloperoxidase and in the main parameters of oxidative stress. Although treatment with curcumin has had beneficial effects, ameliorating or even preventing injury by intestinal IR in the kidneys and especially in the liver of animals, the literature has reported that one of the major difficulties in the oral administration of potentially therapeutic substances is the time of short half-life because it is rapidly metabolized and low absorption, with consequent need for high dosage use. The use of modified drug delivery systems becomes a useful tool to improve the bioavailability of the substance of interest making the treatment more efficient. Previous studies have reported that oral treatment with 10 mg / kg of resveratrol (3,5,4'-trihydroxy-stilbene) in free form is able to ameliorate the damage caused by intestinal IR, however, these beneficial effects are not completely efficient . The use of nanoparticulate systems capable of increasing the bioavailability of resveratrol could be a more efficient alternative for the treatment of intestinal IR. Nanoparticulate systems with high bioadhesive capacity, such as poly (anhydride methyl vinyl ether-co-maleic) or poly (anhydride) (Gantrez® AN 119), could be excellent carriers that would reach the region affected by IR. The development of adhesive interactions between nanoparticulate systems and the intestinal mucosa induces this device to the delivery of this drug through intimate contact with the absorption membrane. We investigated whether resveratrol loaded poly (anhydride) nanoparticles, at a dose of 7 mg / kg body weight, could promote reduction of oxidative stress in the intestinal wall and myenteric neuroprotection through the beneficial effects of resveratrol on the ileum of rats submitted to 45 minutes of ischemia followed by 7 days of reperfusion. For this, nanoparticles of poly (anhydride) containing resveratrol were synthesized and underwent physical-chemical evaluations. To perform the experiment, 54 Wistar rats were divided into nine groups (n = 6 / group) and were treated every 48 hours, starting 5 days before surgery and maintaining treatment for 7 days afterwards (reperfusion period). by gavage with 7 mg / kg body weight of resveratrol (in free or nano-encapsulated form). The superior mesenteric artery was occluded for 45 minutes to cause IR injury. The parameters of oxidative stress, myeloperoxidase, nitrite, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, myeloma neurons and enteric glial cells and the velocity of gastrointestinal transit were evaluated. The physico-chemical evaluations showed that both nanoparticle formulations (with resveratrol and voids) presented negative charge with homogeneous distribution, and the payload presented an encapsulation efficiency of 60%. IR promoted oxidative stress, neuronal loss of the general population, increased neuronal profile of the nitergic subpopulation and vipergic varicosities, glial proliferation (S100-IR), reactive gliosis (GFAP-IR) and slowed gastrointestinal transit time. Treatment with resveratrol administered in the free form prevented changes caused by IR. The results of the groups treated with resveratrol loaded nanoparticles presented similar results to the group treated with free resveratrol. The animals treated with empty nanoparticles (without resveratrol) presented hepatotoxicity. It is important to note that some authors who worked with poly (anhydride) nanoparticles stated that they did not find evidence that they could be absorbed by the intestinal epithelium, only playing the role of bioadhesion and bioavailability of the encapsulated drug. Probably the experimental model employed (45 minutes of ischemia followed by 7 days of reperfusion), promoted the rupture of the epithelial barrier, causing the translocation of the nanoparticles, which may justify the hepatotoxicity found. In addition, we also found some negative changes in the sham group also treated with empty nanoparticles, indicating toxicity in the intestinal tissue. Probably the resveratrol present in the loaded nanoparticles protected the tissues of animals treated with this formulation. We conclude that treatment with empty nanoparticles showed that poly (anhydride) is not an ideal nanocarrier for application in in vivo models of IR intestinal lesion, mainly due to hepatotoxicity that can be caused by dysfunction of the epithelial barrier that triggers the nanoparticle translocation. Both the changes in hepatotoxicity found by the AST and ALT techniques, as well as the oxidative stress changes observed mainly in the liver, strongly indicate that intestinal IR injury affects other organs besides the intestine itself, alerting to the importance of further studies of this organ. pathology. We observed that curcumin and resveratrol are promising therapeutic substances for clinical application, however, pharmaceutical adaptations are needed to improve the efficacy of these substances through targeted release and decreased dosage. Finally, the results demonstrated that despite the importance of therapeutic innovations, not all polymer materials applied as nanocarriers can be considered safe for human health and should be carefully evaluated before reaching the clinical trials stage