Isocitrate lyase as a molecular target for weed suppression : in silico, in vitro and in vivo approaches

Abstract

RESUMO: A Isocitrato liase (ICL, EC: 4.1.3.1) é uma enzima-chave do ciclo do glioxilato expressa em sementes oleaginosas durante o processo de germinação, que juntamente com outras vias metabólicas (B-oxidação e a gliconeogênese), permite a conversão de ácidos graxos em moléculas de glicose, que são fundamentais para o embrião em desenvolvimento. Além de desempenhar este papel central na conversão de reservas lipídicas em carboidratos por meio de sua função anaplerótica, esta enzima não é expressa em mamíferos e outros vertebrados, o que a torna uma candidata promissora como alvo molecular herbicida. Desta maneira, o objetivo do presente estudo foi o de modelar a estrutura tridimensional da ICL de Arabidopsis thaliana por meio de ferramentas de bioquímica computacional no intuito de utilizá-la como alvo em estudos de virtual screening (in silico), e posteriormente analisá-la como alvo molecular herbicida por meio de análises in vitro e in vivo com os ligantes prospectados sobre diversas espécies de plantas daninhas, com a posterior análise dos seus modos de ação. Para isso, a sequência de aminoácidos da ICL de Arabidopsis thaliana (Uniprot id: P28297) foi utilizada para pesquisar padrões estruturais por meio de um BLASTp contra o banco de dados do Protein Data Bank. Após as etapas de modelagem e minimização, a estrutura quartenária final da ICL de A. thaliana (ArThaICL) ligada ao seu substrato glioxilato e ao cofator magnésio foi então utilizada em simulações de redocking por meio dos programas Vina rodado na interface gráfica PyRx e Molegro-6.1. A média de rmsd obtida para a reprodução da pose do isocitrato pelos dois algoritmos foi de 0,571 Å, o que validou o modelo desenvolvido para a etapa de docking molecular. As bibliotecas de compostos analisados foram constituídas pelos inibidores conhecidos da ICL descritos no Brenda Database e pela biblioteca da SigmaAldrich obtida em 2020. Dentre os ligantes encontrados no virtual screening, o itaconato e o tartarato obtiveram bons scores e foram selecionados para testes in vitro e in vivo sobre espécies com diferentes graus de reservas lipídicas, sendo elas: Arabidopsis thaliana, Sesamum indicum, Amaranthus hybridus, Bidens pilosa, Euphorbia heterophylla, Ipomoea grandifolia e Urochloa decumbens. Embora o tartarato não tenha causado efeitos sobre nenhum dos parâmetros analisados, o itaconato, inicialmente pesquisado como antiparasitário em modelo animal, causou alterações diferenciais significativas sobre os parâmetros de crescimento inicial, com uma notável correlação entre inibição no comprimento das plântulas e dependência de reservas lipídicas. As espécies A. thaliana e S. indicum foram as mais afetadas pelo itaconato, com inibições de 81,4 e 68,7%, respectivamente, nos seus comprimentos radiculares, na concentração de 1 mM. As espécies E. heterophylla e B. pilosa apresentaram graus intermediários de inibição com reduções de 27,5 e 38,1%, respectivamente. As espécies restantes, menos dependentes de reservas lipídicas, não apresentaram inibições nos parâmetros de crescimento inicial, o que é um forte indício da atuação deste composto sobre o ciclo do glioxilato. A avaliação dos efeitos do itaconato sobre as atividades in vitro das ICL extraídas dos cotilédones de S. indicum e E. heterophylla demostrou os efeitos diretos deste composto por meio de inibições dose-dependentes, com valores de IC25 (concentração de inibição) e IC50 de 23,49 e 81,74 ?M, para a ICL de S. indicum, respectivamente, e de 23,42 e 67,19 ?M para a ICL de E. heterophylla, respectivamente. Posteriormente, a espécie E. heterophylla foi escolhida para análises adicionais, onde buscou-se compreender os modos de ação do itaconato sobre parâmetros oxidativos e energéticos do seu metabolismo. Inicialmente, as atividades das ICL extraídas dos cotilédones de E. heterophylla, incubados na presença de itaconato 1 mM, foram avaliadas em intervalos 12 de 24 horas até o período final de 120 horas, onde constatou-se inibição da enzima em todos os intervalos testados, o que indica que mesmo sob condições in vivo este tratamento possui a capacidade de atuar sobre o seu alvo molecular em seu compartimento. Posteriormente, foram avaliadas as atividades de enzimas da via glicolítica, da via das pentoses fosfato e do ciclo do ácido cítrico extraídas de cotilédones e raízes de plântulas crescidas na presença de itaconato 1 mM. Foram observadas inibições de 56,5 e 56,7%, para a glicoquinase (GK) de cotilédones e raízes, respectivamente, 66,3%, para a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) de cotilédones, 32,5% para a piruvato quinase (PK) de raízes, e 35,7% para a malato desidrogenase (MDH) de cotilédones. Ainda, a atividade da enzima fosfoenolpiruvato desidrogenase (PEPCK) de cotilédones também apresentou a notável inibição de 60,6%, quando tratadas com itaconato 1 mM nestas mesmas condições. Por outro lado, enzimas do sistema de defesa antioxidante extraídas dos cotilédones de E. heterophylla, testadas sob a mesmas condições, não apresentaram nenhuma alteração significativa, embora uma redução de 21,2% no conteúdo de ROS neste mesmo tecido tenha sido observada. Finalmente, a respiração de ápices radiculares foi inibida de maneira dose-dependente (concentrações de itaconato: 0.25 - 1 mM), com inibições de 36,9 e 48,5% das respirações total e KCN-sensível, respectivamente, pela concentração de itaconato 1 mM, e valores de IC25 de 251,1 e 243,3 ?M, respectivamente. Assim, as alterações metabólicas causadas pelo itaconato foram consequências de sua atuação primária sobre o ciclo do glioxilato, que gerou escassez de substratos para a gliconeogênese, inibindo-a nos cotilédones, o que consequentemente reduziu a mobilização de açúcares (na forma de sacarose) para os meristemas radiculares. A escassez de carboidratos reduziu também a eficiência da respiração celular, gerando assim um deficit energético e escassez de precursores importantes para os processos biossintéticos, com a consequente inibição sobre o desenvolvimento das plântulas de E. heterophylla. O conjunto dos resultados obtidos permite concluir que a ICL desempenha um papel central durante a mobilização das reservas lipídicas e a inibição dessa enzima reduz drasticamente o crescimento inicial das plântulas, por meio de uma deficiência de glicose em um momento crítico do seu desenvolvimento. Esta inibição no desenvolvimento inicial pode reduzir consideravelmente a capacidade das plantas daninhas, dependentes de reservas lipídicas de competirem com as culturas de interesse.

ABSTRACT: Isocitrate lyase (ICL, EC: 4.1.3.1) is a key enzyme of the glyoxylate cycle expressed in oilseeds during the germination process, which, together with other metabolic pathways (B-oxidation and gluconeogenesis), allows the conversion of fatty acids into glucose molecules, which are critical for the developing embryo. In addition to playing this central role in the conversion of lipid stores into carbohydrates through its anaplerotic function, this enzyme is not expressed in mammals and other vertebrates, which makes it a promising candidate as an herbicide molecular target. Thus, the aim of the presente study was to model the three-dimensional structure of the ICL of Arabidopsis thaliana using computational biochemistry tools in order to use it as a target in virtual screening studies (in silico), and later analyze it as an herbicide molecular target through in vitro and in vivo analyzes with the prospected ligands on several weed species, with the subsequent analysis of their modes of action. For this, the amino acid sequence of the Arabidopsis thaliana ICL (Uniprot id: P28297) was used to search for structural patterns through a BLASTp against the Protein Data Bank database. After the modeling and minimization steps, the final quaternary structure of the A. thaliana ICL (ArThaICL) linked to its glyoxylate substrate and to the magnesium cofactor was then used in redocking simulations using the Vina programs running on the PyRx and Molegro- 6.1. The average rmsd obtained for the reproduction of the isocitrate pose by the two algorithms was 0.571 Å, which validated the model developed for the molecular docking step. The libraries of compounds analyzed were constituted by the known inhibitors of ICL described in the Brenda Database and by the SigmaAldrich library obtained in 2020. Among the ligands found in the virtual screening, itaconate and tartrate obtained good scores and were selected for in vitro and in vivo tests on species with different degrees of lipid reserves, namely: Arabidopsis thaliana, Sesamum indicum, Amaranthus hybridus, Bidens pilosa, Euphorbia heterophylla, Ipomoea grandifolia and Urochloa decumbens. Although tartrate had no effect on any of the parameters analyzed, itaconate, initially researched as an antiparasitic in an animal model, caused significant differential changes on initial growth parameters, with a remarkable correlation between inhibition in seedling length and dependence of lipid reserves. The species A. thaliana and S. indicum were the most affected by itaconate, with inhibitions of 81.4 and 68.7%, respectively, in their root lengths, at a concentration of 1 mM. The species E. heterophylla and B. pilosa showed intermediate degrees of inhibition with reductions of 27.5 and 38.1%, respectively. The remaining species, less dependent on lipid reserves, did not show inhibition in the initial growth parameters, which is a strong indication of the action of this compound on the glyoxylate cycle. The evaluation of the effects of itaconate on the in vitro activities of the ICL extracted from the cotyledons of S. indicum and E. heterophylla demonstrated the direct effects of this compound through dose-dependent inhibitions, with values of IC25 (inhibition concentration) and IC50 of 23.49 and 81.74 ?M, for the ICL of S. indicum, respectively, and 23.42 and 67.19 ?M for the ICL of E. heterophylla, respectively. Subsequently, the species E. heterophylla was chosen for further analysis, which sought to understand the modes of action of itaconate on oxidative and energetic parameters of its metabolism. Initially, the activities of the ICL extracted from the cotyledons of E. heterophylla, incubated in the presence of 1 mM itaconate, were evaluated at 24-hour intervals until the final period of 120 hours, when enzyme inhibition was observed at all tested intervals, which indicates that even under in vivo conditions this treatment has the ability to act on its molecular target in its compartment. Subsequently, the activities of 14 enzymes of the glycolytic pathway, the pentose phosphate pathway and the citric acid cycle extracted from cotyledons and roots of seedlings grown in the presence of 1 mM itaconate were evaluated. Inhibitions of 56.5 and 56.7% were observed for glucokinase (GK) from cotyledons and roots, respectively, 66.3%, for glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) from cotyledons, 32.5% for pyruvate kinase (PK) from roots, and 35.7% for malate dehydrogenase (MDH) from cotyledons. Furthermore, the activity of the enzyme phosphoenolpyruvate dehydrogenase (PEPCK) of cotyledons also showed a remarkable inhibition of 60.6%, when treated with 1 mM itaconate under these same conditions. On the other hand, enzymes of the antioxidant defense system extracted from the cotyledons of E. heterophylla, tested under the same conditions, did not show any significant change, although a reduction of 21.2% in the ROS content in this same tissue was observed. Finally, root apexes respiration was inhibited in a dose-dependent manner (itaconate concentrations: 0.25 - 1 mM), with inhibitions of 36.9 and 48.5% of total and KCN-sensitive respirations, respectively, by the concentration of 1 mM itaconate, and IC25 values of 251.1 and 243.3 ?M, respectively. Thus, the metabolic alterations caused by itaconate were consequences of its primary action on the glyoxylate cycle, which generated a shortage of substrates for gluconeogenesis, inhibiting it in the cotyledons, which consequently reduced the mobilization of sugars (in the form of sucrose) to the root meristems. The scarcity of carbohydrates also reduced the efficiency of cellular respiration, thus generating an energy deficit and scarcity of important precursors for biosynthetic processes, with the consequente inhibition of the development of E. heterophylla seedlings. The set of results obtained allows us to conclude that ICL plays a central role during the mobilization of lipid reserves and the inhibition of this enzyme drastically reduces the initial growth of seedlings, through a glucose deficiency at a critical moment in their development. This inhibition of early development can considerably reduce the ability of weeds, dependente on lipid reserves, to compete with the crops.