Reproductive system development in adult rat offspring from maternal protein-caloric restriction is retarded and gender dimorphic

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO: Artigos demonstrando como insultos no início da vida podem interferir no desenvolvimento de uma vida saúdavel, vêm cada vez mais sendo abordados na literatura através do conceito Origens Desenvolvimentistas da Saúde e da Doença (DOHaD). O fenótipo poupador é uma das hipóteses mais comumente citadadas dentro do conceito DOHaD, no qual indivíduos que sofreram desnutrição nas fases iniciais da vida apresentam maiores risco de desenvolver tardiamente doenças cardiovasculares, diabetes e obesidade. Ainda, pré-gestação, gestação, lactação e adolescência representam importantes fases de plasticidade e insultos nesses períodos podem levar a programação metabólicas e fisiológicas. Juntamente, a exposição a outros insultos na vida adulta ou velhice nestes indivíduos que incluem poluição, fármacos, tabaco, tóxicos e mudanças nutricionais, pode acarretar a danos irreversíveis por um disbalanço na homeostase do organismo. A fase da amamentação tanto em humanos como em animais, representa uma fase de desenvolvimento onde mudanças fisiológicas, hormonais e conexões neuronais, ainda continuam sua maturação após o parto. Em ratos os 10 primeiros dias após o nascimento representam uma fase crítica de desenvolvimento onde a fisiologia e comportamento sexual finalizam seu desenvolvimento. Dessa forma, o aumento de casos de infertilidade desde 1990, pode apresentar como um dos fatores insultos pré-natais ou pós-natais, no entanto este possível fator para a infertilidade ainda é pouco abordado na literatura. Por fim, a desnutrição por déficit proteico ainda atinge diversas populações em todo o mundo, atigindo principalmente países em desenvolvimento ou não desevolvidos, consequentemente afetando principalmente pessoas de baixa renda, uma vez que alimentos de alta proteína possuem um valor mais alto que os demais. Da mesma forma, estudos têm apresentado uma relação com pessoas que passaram por períodos de fome no inicio da vida, principalmente na vida pós natal e o aumento de doenças não comunicáveis em adultos. Em adição, a transição nutricional pela mudança abrupta de estilo de alimentação, especialmente pela facilidade em se obter alimentos altamente calóricos mas de baixo valor nutricional, tem sido associada ao aumento da obesidade em jovens, adultos e idosos. OBJETIVOS: Manuscrito 1: Avaliar se a ingestão de baixa proteína materna durante o ínicio da lactação irá afetar a maturação sexual e expressão hipotalâmica de genes sexuais de machos e fêmeas, e exarcebar seus efeitos sob um segundo insulto por uma dieta altamente calórica quando adultos. Manuscrito 2: Analisar se a restrição protéica materna durante um pequeno período da lactação afetará negativamente a função reprodutiva de ratos, pela alterações nos parâmetros espermáticos e na atividade das enzimas antioxidante após ingestão de dieta rica em gordura na idade adulta. Manuscrito 3: Examinar os resultados reprodutivos femininos devido à dieta hipoproteica materna durante os primeiros 12 dias de vida, e como os órgãos reprodutivos femininos responderão diante de um uma mudança na homeostase quando adulto por uma dieta hiperlipídica. MÉTODO Protocolo Experimental Ratos e ratas Wistar com 75 e 85 dias de idade, respectivamente, proveniente do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá (UEM), foram adaptados por 7 dias no biotério do Laboratório de Biologia de Secreções (UEM). Após o período de adaptação os animais mantidos na proporção de duas fêmeas e um macho por gaiola, para se acasalarem. E as fêmeas prenhas, foram transferidas para gaiolas individuais e alimentadas com dieta padrão (Nuvital®; Curitiba / PR, Brasil). O dia do nascimento foi considerado o dia pós-natal (PN) 0. No dia PN 1 a ninhada foi padronizada para oito ou nove filhotes por mãe e sempre que possível mantendo a proporção sexual de 1: 1. Também, no PN 1 as mães foram divididas em dois grupos experimentais (n = 14 / grupo) e receberam, nos primeiros 12 dias de lactação, uma dieta proteíca normal (NP, 20% de proteína; 4128 kcal / Kg), ou uma dieta pobre em proteínas (LP, 4% de proteína; 4128 kcal / Kg). Após PN 21, os filhos machos e fêmeas foram desmamados. Os machos e fêmeas foram separados e alocados quatro animais por gaiola. Do PN 21 ao 60, os animais foram alimentados com dieta padrão (3810 kcal / Kg, Nuvital®; Curitiba / PR, Brasil). No PN 60, as fêmeas descendentes de mães NP e LP foram subdivididas e alimentadas com uma dieta de gordura normal (NF, 4% de gordura; 3810 kcal / Kg) ou uma dieta rica em gordura (HF; 35% de gordura; 5370 kcal / Kg ) até os 90 dias de idade. Assim, foi composto por quatro grupos: NP / NF, prole controle alimentada com dieta com gordura normal (n = 14-15/9 ninhadas); NP / HF, prole controle alimentada com uma dieta rica em gordura (n = 14-15/9 ninhadas); LP / NF, prole com baixo teor de proteína alimentada com uma dieta com gordura normal (n = 15/9 ninhadas); e LP / HF, prole com baixo teor de proteína alimentada com dieta rica em gordura (n = 15/9 ninhadas ). Todos os animais ao longo dos procedimentos experimentais foram mantidos em condições controladas de temperatura (23 ° C ± 2 ° C) e fotoperíodo (7h00 às 19h00, ciclo de luz). As femêas ao PN 90 foram eutanasiadas apenas em estro, para apresentarem um padrão hormonal similar. RESULTADOS E DISCUSSÃO Manuscrito 1: O presente estudo mostrou que a restrição na lactação foi capaz de alterar a composição do leite e, como consequência, a ingestão de leite dos filhotes, sem alterações na produção. Além disso, observamos um atraso no início da puberdade em ambos os sexos. Pela primeira vez, mostramos que a resposta de expressão de Kiss1 e Gnrh1 foi sexualmente dimórfico de acordo com a fase da vida e tratamento utilizado, sendo as fêmeas aparentemente mais resistentes às mudanças de expressão gênica causadas no início da vida pela restrição protéica. Manuscrito 2: Foi observado neste trabalho que a dieta de baixa proteína materna durante a amamentação afetou o número de espermatozoides em testículos e epidídimos, e a produção diária de espermatozóides. Também, alterações nos paramêtros de estresse oxidativo foi observada nos órgãos analisados dos grupos submentidos a baixa proteína e a dieta de alta gordura na vida adulta, além de alterações na morfologia e motilidade espermática porém os testículos apresentaram mais resistencia aos danos oxidativos do que o epidídimo. Manuscrito 3: Neste estudo a restrição protéica materna durante um curto periodo na lactação induziu uma redução do peso corporal ao longo do período experimental, aumento do número de corpos lúteos e mudanças nos paramêtros de estresse oxidativo dos ovários. Enquanto poucas alterações foram observadas no útero, com diminuição no número de glandulas endotelias aos 21 dias de vida e aumento de lipí205deo peroxidação nos três grupos analisados aos 90 dias de idade. A ingestão de uma dieta rica em gordura nos animais que passaram pelo insulto pós natal no início da vida, apresentaram diminuiçao nos dias em estro, apresentando similariedades na estrutura dos ovários e paramêtros de estresse oxidativo ao grupo controle, que não passou por nenhum insulto em nenhuma fase da vida. CONCLUSÃO Manuscrito 1: Nós mostramos que a dieta hipoproteica materna afetou a composição do leite como uma resposta adaptativa para evitar danos na ninhada. Nossos resultados também demonstraram uma resposta diversificada na expressão dos genes sexuais sobre diferentes estressores em diversos momentos da vida, assim como essas respostas foram dimorficas entre machos e fêmeas. Manuscrito 2: No presente estudo, podemos concluir que a desnutrição pós-natal por uma dieta pobre em proteínas pode interferir nos parâmetros espermáticos e alterações nos paramêtros de estresse oxidativo após um segundo insulto tardiamente, o que podem afetar a reprodução masculina na vida adulta. Além disso, o período de amamentação representa uma importante fase de plasticidade e o insulto causado pela baixa proteína neste período pode induzir a programação da fisiologia do sistema reprodutivo ao longo da vida animal. Manuscrito 3: Nossos resultados sugerem que uma dieta de baixa proteína materna pode causar insultos ovarianos e uterinos e uma possível antecipação da menopausa. Surpreendentemente, o consumo da dieta rica em gordura no grupo que passou pela desnutrição proteica no início da vida, somente apresentou alterações no ciclo estral. No entanto essa diminuição no número de estros seria o suficiente para reduzir a capacidade reprodutiva desse animal, explicando as alterações encontradas neste grupo. Dessa forma, o período lactacional representa uma fase importante do desenvolvimento e resultando em adaptações na fisiologia reprodutiva feminina, da mesma forma o segundo insulto pela dieta rica em gordura casou um desregulação na homeostase das fêmeas que receberam a baixa proteína na lactação, resultado em uma diminuição da atividade ovariana.

ABSTRACT: INTRODUCTION Some studies have been showing how insults early in life can interfere with the development of a healthy life, and it is being addressed in the literature through the concept of Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD). The thrifty phenotype is one of the most commonly cited hypotheses inside the DOHaD concept, in which individuals who suffered malnutrition in the early stages of life present more risk of developing cardiovascular diseases, diabetes, and obesity late in life. Still, pre-pregnancy, pregnancy, lactation, and adolescence represent important phases of plasticity, and insults in these periods can lead to metabolic and physiological programming and exposure to other insults in adulthood or old age in these individuals, which include pollution, drugs, tobacco, toxic and nutritional changes, can cause irreversible damage due to an imbalance in the homeostasis of the organism. Together, the breastfeeding phase in both humans and animals represents a developmental phase where physiological and hormonal changes and neuronal connections still continue maturation after delivery. In rats, the first 10 days after birth characterizes a critical stage of development where physiology and sexual behavior end their development. Thus, the increase in infertility cases since 1990, may present as one of the factors prenatal or postnatal insults, however, this possible factor for infertility is still little addressed in the literature. Finally, malnutrition due to protein deficit still affects several populations around the world, affecting mainly developing or undeveloped countries, mostly affecting low-income people, since high-protein foods have a higher value than the others. Likewise, studies have shown a relationship between people who went through periods of hunger early in life, especially in post-natal life, and the increase in non-communicable diseases in adults. In addition, the nutritional transition due to the abrupt change in the style of eating has also been growing in recent years, especially due to the ease in obtaining high-calorie foods, but with low nutritional value, resulting in obesity in young people, adults, and the elderly. AIMS Manuscript 1: Assess whether the ingestion of low maternal protein during early lactation will affect sexual maturation and hypothalamic expression of male and female sexual genes and exacerbate its effects under a second insult for a high-calorie diet when adults. Manuscript 2: To analyze whether maternal protein restriction during a short period of lactation will negatively affect the reproductive function of male rats, due to changes in sperm parameters and oxidative stress parameters after overfed in adulthood. Manuscript 3: Examine the female reproductive results due to the maternal low-protein diet during the first 12 days of life, and how the female reproductive organs will respond to a change in homeostasis as an adult by a high-fat diet. METHODS Experimental Protocol Female and male Wistar rats, 75 and 85 days old, respectively, from the animal house central of the State University of Maringá (UEM), were adapted for 7 days in the animal house of the Secretion Biology Laboratory (UEM). After the adaptation period, animals kept in the proportion of two females and one male per cage, to mate. And the pregnant females were transferred to individual cages and fed a standard diet (Nuvital®; Curitiba / PR, Brazil). The day of birth was considered the postnatal day (PN) 0. On day PN 1 the litter was standardized to eight or nine puppies per mother and the sex ratio of 1: 1, if possible. Also, in PN 1 the mothers were divided into two experimental groups (n = 14/ group) and received, in the first 12 days of lactation, a normal protein diet (NP, 20% protein; 4128 kcal/kg), or a low protein diet ( LP, 4% protein; 4128 kcal / Kg). After PN 21, the male and female children were weaned. Males and females were separated, and four animals were allocated per cage. From PN 21 to 60, the animals were fed a standard diet (3810 kcal / Kg, Nuvital®; Curitiba / PR, Brazil). In PN 60, females descended from mothers NP and LP were subdivided and fed a normal fat diet (NF, 4% fat; 3810 kcal / Kg) or a high-fat diet (HF; 35% fat; 5370 kcal / Kg) up to 90 days of age. Composing four groups: NP / NF, control offspring fed a normal fat diet (n = 14-15 / 9 litters); NP / HF, control offspring fed a high-fat diet (n = 14-15 / 9 litters); LP / NF, low-protein offspring fed a normal fat diet (n = 15/9 litters); and LP / HF, low-protein offspring fed a high-fat diet (n = 15/9 litters). All animals throughout the experimental procedures were kept under controlled conditions of temperature (23 ° C ± 2 ° C) and photoperiod (7 am to 7 pm, light cycle). The females at PN 90 were euthanized only in estrus, to present a hormonal pattern. RESULTS AND DISCUSSION Manuscript 1: The present study showed that the lactation restriction was able to alter the composition of the milk and, as a consequence, the milk intake of the puppies, without changes in production. In addition, we observed a delay in the onset of puberty in both sexes. For the first time, we showed that the expression response of Kiss1 and Gnrh1 was sexually dimorphic according to the stage of life and treatment used, with females apparently more resistant to changes in gene expression caused early in life by protein restriction. Manuscript 2: It was observed in this study that the low maternal protein diet during breastfeeding affected the number of sperm in testicles and epididymis and caused a daily in the sperm production. Also, changes in the oxidative stress parameters were observed in the organs analyzed organs of the groups submitted to low protein and the high-fat diet in adulthood, in addition to changes in sperm morphology and motility, being the testicles more resistant to oxidative damage than the epididymis. Still the male reproductive organs analyzed showed to suffer a plasticity due the insult in early life, since the oxidative stress parameters was altered in these animals, and the intake of high-fat caused an organism homeostasis disbalance, which can be observed by the reduction in the sperm quality. Manuscript 3: In this study, maternal protein restriction during a short period during lactation induced a reduction in body weight throughout the experimental period, an increase in the number of corpus luteum, and changes in the oxidative stress parameters of the ovaries. While few changes were observed in the uterus, with a decrease in the number of endometrial glands at 21 days of life and an increase in lipid peroxidation in the three groups analyzed at 90 days of age. The intake of a high-fat diet in animals that went through the postnatal insult early in life, showed a decrease in estrus days, being similar in the ovaries structure and oxidative stress parameters to control group, which did not undergo any insult at any stage of life. CONCLUSION Manuscript 1: We showed that the maternal protein restriction diet affected the composition of the milk as an adaptive response to prevent damage to the litter. Our results also demonstrated a diversified response in the expression of sexual genes over different stressors at different times in life, as well as these responses were dimorphic between males and females. Manuscript 2: In the present study, we can conclude that postnatal malnutrition from a low protein diet can interfere with sperm parameters and changes in the oxidative stress parameters after a second insult late, which can affect male reproduction in adulthood. In addition, the breastfeeding period represents an important phase of plasticity and the insult caused by low protein in this period can induce the programming of the physiology of the reproductive system throughout animal life. Manuscript 3: Our results suggest that a low maternal protein diet can cause ovarian and uterine insults and possible anticipation of menopause. Surprisingly, the consumption of a high-fat diet in the group that experienced protein malnutrition in early life only showed changes in the estrous cycle. However, this decrease in the number of estrus would be enough to reduce the reproductive capacity of this animal, explaining the changes found in this group. Thus, the lactation period represents an important stage of development, which results in adaptations in female reproductive physiology. In the same way, the second insult for the high-fat diet caused a dysregulation in the homeostasis of the females who received low protein during lactation, demonstrating a decreased in the ovarian activity.