Construção e caracterização de uma estirpe de Herbaspirillum seropedicae mutante no gene glnE

Abstract

Resumo: A assimilação de nitrogênio ambiental na biomassa bacteriana envolve a utilização de diversas vias metabólicas, e a escolha da via utilizada em um determinado momento permite a adaptação do metabolismo bacteriano para as condições encontradas. Assim, o fluxo metabólico através das vias de assimilação de nitrogênio é fortemente regulado, tanto para que a concentração intracelular das moléculas nitrogenadas seja mantida dentro de um intervalo fisiologicamente salutar, quanto para economia de energia. A principal fonte de nitrogênio da maior parte das bactérias é o amônio, o qual pode ser assimilado por duas vias metabólicas distintas: a via da glutamina sintetase (GS) e a via da glutamato desidrogenase (GDH). A via GS, alvo do presente trabalho, é fortemente regulada em resposta aos níveis de nitrogênio ambiental. A enzima GS bacteriana possui 12 subunidades idênticas, separadas em dois anéis hexaméricos unidos "face-a-face". Cada dodecâmero possui 12 sítios ativos entre os monômeros. Durante a sua atividade catalítica, a GS consome uma ligação de alta energia do ATP, exigindo um nível de controle refinado para evitar atividade desnecessária quando oamônio no meio é abundante, o que levaria a um desperdício de energia. O modelo de regulação da enzima GS foi bem descrito principalmente em Escherichia coli e em Rhodospirillum rubrum. Nesses modelos mais bem estudados, a GS é regulada em dois níveis distintos. Uma forma de regulação ocorre por inibição alostérica em resposta a diversas moléculas, tais como alguns aminoácidos, glicosamina-6-fosfato, carbamil fosfato, CTP e AMP. Além disso, a GS dessas bactérias também é regulada por adenililação (adição de um AMP) reversível em um resíduo conservado de tirosina da enzima. A adenililação causa uma diminuição da atividade catalítica e uma maior sensibilidade de GS aos inibidores alostéricos, levando a uma diminuição do fluxo metabólico por essa via de assimilação de amônio. Cada uma das subunidades de GS pode ser adenililada, e a inibição da atividade é maior quanto maior for a quantidade de subunidades adenililadas. Essa modificação pós-traducional é adicionada em condições de altas concentrações de amônio, e removida quando as concentrações de amônio caem. A flutuação entre os estados de GS modificada e não modificada permite que a célula se adapte a variações nas condições ambientais. Tanto a adição do grupamento AMP ao resíduo conservado de tirosina quanto a sua remoção são catalisadas pela enzima bifuncional GlnE. GlnE possui uma arquitetura que remete à duas enzimas "fundidas": A ATase, que adiciona grupamentos AMP à tirosina a partir do ATP, e a AR, que retira os grupamentos AMP por uma reação de fosforólise. A regulação recíproca das atividades ATase e AR permite uma regulação justa e eficiente do fluxo metabólico através de GlnE. Dessa forma, a compreensão do metabolismo de assimilação de nitrogênio de uma bactéria exige um entendimento do mecanismo regulatório de GlnE. Em E. coli e R. rubrum, a regulação das atividades ATase e AR de GlnE é exercida pela proteína GlnB, pertencente à família de proteínas PII de transdução de sinal. No entanto, em H. seropedicae há evidências de trabalhos anteriores de que o modelo de regulação das atividades enzimáticas de GlnE pode ser substancialmente diferente daquele encontrado nos sistemas ortólogos citados. Para a melhor compreensão dessa regulação, nesse trabalho nós construímos uma estirpe de H. seropedicae com uma deleção em fase do gene glnE e iniciamos a caracterização do mesmo. A estirpe mutante foi denominada EL?glnE. Nos experimentos de caracterização da estirpe EL/\glnE de H. seropedicae nós encontramos fenótipos de crescimento da bactéria em determinadas fontes de nitrogênio. Quando nitrato foi adicionado como única fonte de nitrogênio, nenhum crescimento da estirpe mutante foi observado. Na presença de altas concentrações de amônio, a curva de crescimento da estirpe mutante apresentou uma fase lag mais longa do que a selvagem, no entanto, quando entrou em fase exponencial de crescimento, a taxa de crescimento e tempo de geração foram semelhantes à estirpe selvagem. Quando glutamato foi adicionado, por sua vez, como única fonte de nitrogênio, a curva de crescimento da estirpe mutante foi semelhante à da estirpe selvagem, indicando que o fenótipo de crescimento só é visualizado em condições de grande disponibilidade de nitrogênio. Nós também verificamos a atividade da enzima GS das estirpes selvagem e mutante EL/\glnE em alto amônio e baixo glutamato. Os resultados mostraram que, como esperado, a atividade da enzima GS da estirpe selvagem foi regulada de acordo com a disponibilidade de nitrogênio, sendo maior na condição de baixo glutamato. No entanto, na estirpe mutante EL/\glnE, nenhuma alteração de atividade da enzima GS foi observada nas diferentes condições de nitrogênio testadas. Também foi verificada a fixação de nitrogênio da estirpe mutante EL/\glnE. As estirpes selvagem e mutante foram crescidas em meio semi-sólido e a atividade nitrogenase foi verificada pela capacidade de redução do acetileno a etileno. Os resultados indicaram que a fixação de nitrogênio não foi afetada pela deleção do gene glnE, pelo contrário, uma atividade de nitrogenase ligeiramente maior foi encontrada. As implicações dos fenótipos encontrados estão na discussão do trabalho

Abstract: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio capaz de colonizar os tecidos internos de gramíneas com grande interesse econômico e estimular o seu crescimento. A principal via de assimilação de amônio de H. seropedicae tem como primeiro passo a condensação do amônio a uma molécula de glutamato para formar glutamina, em uma reação catalisada pela enzima glutamina sintetase (GS). A GS tem sua atividade pós-traducional regulada por uma adenililação reversível. Tanto a adição do grupamento adenilil, quanto sua remoção, são catalisados pela enzima bifuncional GlnE. Os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da assimilação de amônio em H. seropedicae ainda não são conhecidos. Para contribuir com o conhecimento desses mecanismos, nesse trabalho nós construímos uma estirpe de H. seropedicae com uma deleção do gene glnE e iniciamos a caracterização da mesma. Os resultados mostraram que a estirpe mutante tem uma atividade de nitrogenase ligeiramente maior do que da estirpe selvagem. Além disso, a deleção causa um prejuízo no crescimento da bactéria quando nitrato é a única fonte de nitrogênio. Quando o amônio é a fonte de nitrogênio, a fase lag de crescimento da estirpe mutante é maior do que da estirpe selvagem. Os resultados permitiram aumentar o conhecimento sobre a regulação da assimilação de amônio em H. seropedicae.