Efeitos do B-cariofileno isolado do óleo de cravo sobre a lesão pulmonar aguda induzida por lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos

Abstract

Resumo: INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma síndrome de insuficiência respiratória caracterizada por infiltração pulmonar difusa, edema e hipoxemia grave. Os fatores de risco para a LPA incluem pneumonia, trauma, sepse, choque,e, mais recentemente, COVID-19. Cerca de 30% dos pacientes com COVID-19 desenvolvem LPA. A fisiopatologia da LPA envolve uma intensa resposta inflamatória pulmonar associada com edema, ativação de macrófagos e recrutamento de neutrófilos. Os neutrófilos e macrófagos ativados secretam espécies reativas de oxigênio e proteases que lesam o epitélio alveolar. A LPA induzida por lipopolissacarídeo (LPS) é um modelo de inflamação pulmonar em camundongos que apresenta muitas semelhanças com a LPA humana. O B-cariofileno (B-Cary) é um sesquiterpeno encontrado em óleos essenciais e tem sido relatado que apresenta atividade anti-inflamatória. Este composto é o segundo mais abundante (6 - 17%) do óleo essencial extraído dos botões de cravo, depois do eugenol que corresponde a 70-90%. Até o momento nenhum estudo foi realizado para verificar se o B-Cary melhora a inflamação da LPA. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do ?-Cary isolado do óleo de cravo na LPA induzida por LPS em camundongos, quando administrado oralmente. MÉTODOS:O B-Cary do óleo de cravo foi adquirido da Quinarí Fragrâncias e Cosméticos Ltda (Ponta Grossa, PR, Brasil) e caracterizado quimicamente por cromatografia gasosa com espectrometria de massa (GC-MS), revelando pureza de 91%. A quimiotaxia in vitro foi realizada em câmara de Boyden usando neutrófilosda cavidade peritoneal de camundongos com peritonite induzida por zimosan. As células foram incubadas com B-Cary nas concentrações de 3, 10, 30 e 90 ?g/mL por 30 min e fMLP foi o agente quimioatraente. A viabilidade celular, pelo método de MTT, e o ensaio de fagocitose foram realizados com B-Cary nas mesmas concentrações. Para os experimentos in vivo, camundongos BALB-c foram tratados oralmente com veículo ou ?-Cary em doses de 50, 100, 200 e 400 mg/kg. Após 1 h, os animais foram anestesiados e receberam 5 mg/kg de LPS ou solução salina (controle) por via intranasal para induzir LPA. Após 24 h, os animais foram eutanaziados e lavado brônquico-alveolar (LBA) e tecido pulmonar foram coletados. Células totais e polimorfonucleares (PMN) foram contadas e a concentração de óxido nítrico foi verificada no LBA. As razões peso úmido/ seco (W/D) do pulmão foram utilizadas para determinar o edema pulmonar. A atividade da mieloperoxidase (MPO) e a liberação de citocinas pró-inflamatórias foram medidas no tecido pulmonar. O protocolo animal foi aprovado pelo CEUA da UEM. ANOVA ONE-WAY (e teste post hoc de NeumanKeuls) e teste t de Student (p <0,05) foram usados para analisar a significância estatística dos dados. RESULTADOS E DISCUSSÃO: O ensaio de quimiotaxia in vitro mostrou que o fMLP induziu uma migração leucocitária significativa quando comparado com o grupo controle (RPMI 1640). Após a incubação dos neutrófiloscom B-Cary (3, 10, 30 e 60 ug /mL), foi observada uma redução significativa da migração de neutrófilosem resposta à estimulação de fMLP. Nossos resultados demonstraram que o B-Cary diminuiu significativamente a capacidade fagocitária dos neutrófilos em todas as concentrações testadas, quando comparado ao grupo LPS. Os camundongos do grupo LPS apresentaram um aumento significativo do número de neutrófilos no LBA, o qual foi relacionado à migração de PMN. O tratamento com 100, 200 e 400 mg/ kg de B-Cary reduziu a migração de neutrófilos em 35%, assim como o número de PMN. O acúmulo de neutrófilos no pulmão foi avaliado pela atividade de MPO, que aumentou após a administração de LPS. O tratamento com 100, 200 e 400 mg/kg de B-Cary reduziu a atividade de MPO em 43%. Os efeitos do B-Cary na razão W/D do pulmão induzida por LPS foram medidos para avaliar o edema pulmonar neste estudo. Os resultados demonstraram que o desafio com LPS aumentou significativamente a razão W/D do pulmão. Em comparação com o grupo LPS, B-Cary (200 mg/kg) inibiu notavelmente a razão W/D pulmonar induzida por LPS. A produção de NO foi monitorada medindo-se o nível de nitrito no LBA por meio da reação de Griess. A administração intranasal de LPS aumentou significativamente os níveis de NO no LBA, que foram significativamente atenuados após o tratamento com B-Cary (em todas as doses testadas). As citocinas iniciam, amplificam em cascata e perpetuam a resposta inflamatória na LPA. Nossos resultados mostraram que o aumento da citocina inflamatória induzida por LPS, IL-1B, também foi inibida por B-Cary (200 mg / kg). Em relação à citocina anti-inflamatória IL-10, o LPS reduziu os níveis da citocina IL-10 no pulmão e o B-Cary (200 mg / kg) foi capaz de aumentar os níveis dessa citocina. CONCLUSÃO: No geral, este estudo sugere que B-Cary melhora a LPA em camundongos por meio da atenuação da migração de neutrófilos para os pulmões, e esse efeito parece estar relacionado à capacidade do B-Cary em reduzir os níveis de citocinas inflamatórias, tais como a IL-1B

Abstract: BACKGROUND: Acute lung injury (ALI) is a respiratory failure syndrome characterized by diffuse pulmonary infiltration, edema and severe hypoxemia. Risk factors for ALI include pneumonia, trauma, sepsis, and, more recently, COVID-19 [1], with nearly 30% of patients with COVID-19 developing ALI. The pathophysiology of ALI involves an intense pulmonary inflammatory response associated with edema, macrophages activation and neutrophils recruitment. Neutrophils and activated macrophages secrete reactive species and proteases, which damage the alveolar epithelium. The lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) is a model of lung inflammation in mice that shares many features of human ALI. (-)-B-caryophyllene (B Cary) is a sesquiterpene found in essential oils and has been reported to present anti- inflammatory activity. This compound is the second most abundant (6-17%) of the essential oil extracted from clove buds, after eugenol that comprises 70- 90%. To date, no study has been carried out to verify whether B-Cary improves the inflammation in ALI. Thus, this work aimed at evaluating the effects of B-Cary isolated from clove oil on LPS-induced ALI in mice, when orally administered. METHODS: B-Cary from clove bud oil was purchased from QuinaríFragrâncias e CosméticosLtda (Ponta Grossa, PR, Brazil) and chemical characterized by gas chromatography with mass spectrometry (GC-MS), revealing a purity of 91%. Chemotaxis in vitro was carried out in Boyden chambers using leukocytes from the peritoneal cavity of mice with zymosan-induced peritonitis. The cells were incubated with B-Cary at the concentrations of 3, 10, 30 and 90 ?g/mL for 30 min and fMLP was the chemoattractant. Cell viability, by MTT methods, and phagocytosis assay was performed with B-Cary at the same concentrations. For in vivo experiments, BALB-c mice were orally treated with vehicle or B-Cary at doses of 50, 100, 200 e 400 mg/kg. After 1 h, anesthetized animals received 5 mg/kg LPS or saline (control) intranasally to induce ALI. After 24 h, the animals were euthanized and bronchial alveolar lavage (BAL) and lung tissue was collected. Total and polymorphonuclear cells (PMN) were counted and nitric oxide concentration was verified in the BAL.Lung wet/dry (W/D) ratios was utilized to lung edema determined. Myeloperoxidase (MPO) activity and release of pró-inflammatory cytokines were measured in the lung tissue. The animal protocol was approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of UEM. ANOVA ONE-WAY (and Neuman Keuls post hoc test) and student t test (p<0.05) were used to analyze the statistical significance of data. RESULTS AND DISCUSSION: In vitro chemotaxis assay showed thatfMLP induced a significant leukocyte migration when compared with the control group (RPMI 1640). After leukocytes incubation with B-Cary (3, 10, 30, and 60 ug/mL) a significant reduction of leukocyte migration in response to fMLP stimulation was observed.Our results demonstrated that B-Cary decreased significantly the neutrophils phagocytic ability at all tested concentrations, when compared with LPS group.Mice of the LPS group showed a significant increase of the number of leukocytes in the BAL, which was related to the migration of PMN. Treatment with 100, 200 and 400 mg/kg B-Cary reduced the leucocytes migration by 35% as well as the number of PMN. The accumulation of neutrophils in the lung was assessed by the MPO activity, which increased after LPS administration. Treatment with 100, 200 and 400 mg/kg B-Cary reduced MPO activity by 43%. The effects of B-Cary on LPS-induced lung W/D ratio were measured to assess lung edema in this study. The results demonstrated that LPS challenge significantly increased the lung W/D ratio. Compared to the LPS group, B-Cary (200 mg/kg) remarkably inhibited LPS-induced lung W/D ratio. The NO production was monitored by measuring the nitrite level in the BAL through the Griess reaction. Intranasal administration of LPS significantly increased NO levels in BAL, that were significantly attenuated after B-Cary treatment (at all doses tested). Cytokines initiate, amplify, and perpetuate the cascade inflammatory response in ALI. Our results showed that the increased LPS-induced inflammatory cytokine IL-1?, were also inhibited by B-Cary (200 mg/kg). Regarding the IL-10 anti-inflammatory cytokine, LPS reduced IL-10 cytokine levels in the lung and B-Cary (200 mg/kg) was able to increased this cytokine levels. CONCLUSION:Overall, this study suggests that B-Cary improves ALI in mice by means of attenuating the neutrophils migration to the lungs, and this effect appears to be related to B-Cary ability in reduce inflammatory cytokine levels, such as IL-1B