Análise morfo-histopatológica e expressão de esterases em Bombyx mori L. infectados com Nucleopolyhedrovirus e submetidos ao fármaco antiviral Bm5

Abstract

A espécie Bombyx mori (Linnaeus, 1758) conhecida popularmente como bicho-da-seda é um inseto pertencente à ordem Lepidoptera. Este inseto é criado massalmente com fins comerciais, pois o fio de seda que serve como matéria-prima para a confecção de seu casulo é usado amplamente pela indústria têxtil. A sericicultura é uma atividade que abrange o cultivo da amoreira (Morus sp.), cujas folhas são o único alimento do bicho-da-seda e, no Brasil, a sua criação se inicia com a obtenção dos ovos pela indústria até o cultivo das lagartas no campo pelos agricultores familiares que retornam os casulos para a indústria. Os maiores problemas que ameaçam a sericicultura no Brasil e no mundo são as doenças causadas por diversos patógenos. De todas as doenças, as de origem viral são as mais graves e representam um sério problema para a sericicultura mundial. O vírus da poliedrose nuclear (NPV), em específico, Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), um Alphabaculovírus da família Baculoviridae,é um patógeno altamente infectivo que causa uma doençaconhecida por amarelidão nesses insetos. Este vírus produz estruturas de resistência chamadas de corpos de oclusão virais - OBs (Occlusion Bodies)que são capazes de persistir por um longo período de tempo no meio ambiente. A transmissão ocorre comumente por via oral quando as lagartas ingerem o alimento contaminado com os OBs. Durante a infecção, o inseto fica debilitado, perdendo sua capacidade motora e de alimentação e, consequentemente, o desenvolvimento da lagarta é afetado levando a um interrompimento do seu crescimento. Quando a lagarta do inseto infectada pelo vírus morre, seus tecidos internos apresentamliquefação e seu tegumento desintegra-se facilmente, liberando grande quantidade de OBs no meio, servindo de inóculo para infectar outros insetos hospedeiros. Estes processos são facilitados pela interação sinérgica entre os produtos gênicos virais v-cath (uma catepsina viral) e chiA (uma quitinase viral). O fármaco antiviral Bm5, construído através de modelagem molecular para inibir a catepsina viral de BmNPV, age como um preventivo à infecção viral, pois reduz a proliferação viral do hospedeiro contaminado, evitando assim, perdas drásticas de casulos em propriedades sericícolas.Neste contexto, o objetivo deste trabalho foianalisar os efeitos do fármaco Bm5 diluído em Pluronic F- 127 na expressão gênica de esterases do intestino médio e corpo gorduroso, pois estas enzimas desempenham um importante papel no metabolismo de compostos endógenos e exógenos no organismo de insetos. Bem como,analisar a morfologia e a citopatologia da infecção no intestino médio, corpo gorduroso e tegumento. As análises das esterases foram realizadas por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida. Para as análises morfológicas foram realizadas microscopia eletrônica de varredura, bem como, a técnica de histologia com colorações em hematoxina e eosinae, em Azan modificado para corpos de oclusão virais.Não foi observada inibição ou expressão de nenhuma banda esterásica diferente das determinadas no padrão eletroforético, o que indica que a infecção viral ou mesmo o tratamento com o fármaco Bm5não alteraram o perfil enzimático. As análise smorfológicas nos revelaram que alterações mais severas ocorrem nos tecidos de lagartas infectadas com o BmNPV sem o fármaco, indicativo de que o mesmo está agindo minimizando os efeitos da ação viral sobre diferentes tecidos. A análise adequada dos efeitos desse fármaco em nível molecular e morfológico cria a perspectiva de poder aplicar futuramente os resultados deste estudo para o monitoramento dessa doença viral na sericicultura.

Abstract: The Bombyx mori species (Linnaeus, 1758) popularly known as silkworm is an insect belonging to the order Lepidoptera. This insect is created massively for comercial purposes, since the silk thread that serves as raw material for the making of its cocoon is used widely by the textile industry. Sericulture is an activity that covers the cultivation of mulberry (Morus sp.), whose leaves are the only food of the silkworm and, in Brazil, their creation begins with the production of eggs by the industry until the cultivation of caterpillars in the field by family farmers who return cocoons to the industry. The biggest problems that threaten sericulture in Brazil and in the world are the diseases caused by several pathogens. Of all diseases, those of viral origin are the most serious and represent a serious problem for sericulture worldwide. The nuclear polyhedrosis virus (NPV), in particular, Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), an Alphabaculovirus of the Baculoviridae family, is a highly infectious pathogen that causes a disease known for "yellowing" in these insects. This vírus produces resistance structures called viral occlusion bodies - OBs that are able to persist for a long period of time in the environment. Transmission commonly occurs orally when caterpillars ingest food contaminated with OBs. During the infection, the insect is weakened, losing its motor and feeding capacity and, consequently, the development of the caterpillar is affected leading to an interruption of its growth. When the caterpillar of the insect infected dies, its internal tissues show liquefaction and its integument disintegrates easily, releasing large numbers of OBs in the environment, serving as an inoculum to infect other host insects. These processes are facilitated by the synergistic interaction between the viral gene products v-cath (a viral cathepsin) and chiA (a viral chitinase). The antiviral drug Bm5, built through molecular dockingto inhibit the viral cathepsin of BmNPV, acts as a preventive to viral infection, as it reduces the viral proliferation of the contaminated host, thus preventing drastic loss of cocoons in sericultural properties. In this context, the objective of this work was to analyze the effects of the drug Bm5 diluted in Pluronic F-127 on the gene expression of esterases of the midgut and fat body, as these enzymes play an important role in the metabolism of endogenous and exogenous compounds in the insect organism. As well as, analyze the morphology and cytopathology of the infection in the midgut, fat body and integument. The esterase analyzes were performed using the polyacrylamide gel electrophoresis technique. For morphological analysis, scanning electron microscopy was performed, as well as the histology technique with hematoxylin and eosin stains and, in modified Azan for viral occlusion bodies. No inhibition or expression of any stereic band other than those determined in the electrophoretic pattern was observed, which indicates that viral infection or even treatment with the drug Bm5 did not alter the enzyme profile. Morphological analysis revealed that more severe changes occur in the tissues of caterpillars infected with BmNPV without the drug, indicating that it is acting to minimize the effects of viral action on different tissues. The proper analysis of the effects of this drug at the molecular and morphological level creates the perspective of being able to apply the results of this study in the future to monitor this viral disease in sericulture.