Caracterização molecular de isolados de Aspergillus flavus de amendoim do sul do Brasil e atividade antifúngica de óleos essenciais

Abstract

Introdução: Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos. Aflatoxinas são micotoxinas hepatotóxicas, mutagênicas, e carcinogênicas. Há quatro tipos principais aflatoxinas, chamadas B1, B2, G1 e G2. A espécie Aspergillus flavus é produtora de aflatoxinas, mas apenas 40-50% dos isolados desta espécie podem produzir estas micotoxinas, e somente as aflatoxinas B1 e B2. A razão de alguns isolados de A. flavus produzirem aflatoxinas e outros não ainda não está bem estabelecida. A espécie A. flavus pode contaminar grãos como o amendoim. O uso de conservantes naturais, como óleos essenciais, é uma opção para o controle da contaminação de alimentos. Objetivos: Avaliar a presença e obter isolados de A. flavus em grãos de amendoim cru comercializados na cidade de Maringá, Paraná, Brasil; identificar os isolados ao nível de espécie por DNA barcoding; avaliar o perfil de produção de aflatoxinas dos isolados por meio de técnicas em meio de cultivo e cromatografia; investigar a variabilidade genética dos isolados; e analisar o efeito antifúngico de cinco óleos essenciais em alguns dos isolados. Materiais e métodos: Inicialmente, amostras de amendoim foram compradas em mercados da cidade de Maringá. Grãos de cada amostra foram colocados em meio de cultivo sólido específico para Aspergillus spp. Foi feita a contagem dos grãos contaminados com Aspergillus spp. e foram feitos isolamentos monospóricos para obtenção de isolados. Os isolados monospóricos foram identificados por caracterização morfológica e DNA barcoding. A produção de aflatoxinas dos isolados foi testada por cultivo em meio sólido de leite de coco, exposição a vapor de hidróxido de amônio e cromatografia em camada delgada (TLC). Uma análise filogenética foi realizada com amplificação e sequenciamento da região ITS-5,8rRNA e de uma região do gene da ?-tubulina. A variabilidade genética foi analisada com reações de PCR com oito iniciadores de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e três de ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) com o DNA de 11 dos isolados obtidos neste trabalho e de quatro isolados de A. flavus obtidos de trigo para quibe em um estudo prévio. A atividade de inibição do crescimento micelial de cinco óleos essenciais foi testada com alguns dos isolados. Resultados e discussão: Onze isolados monospóricos de A. flavus e um de Aspergillus caelatus foram obtidos. Cinco isolados de A. flavus foram identificados como aflatoxigênicos em meio de cultivo e oito na análise de TLC, onde foi evidenciada a produção de aflatoxinas dos tipos B1 e B2. Na análise filogenética, somente o isolado de A. caelatus (UEM 4-1) não agrupou com os isolados de A. flavus, os quais eram filogeneticamente idênticos. As análises de RAPD e de ISSR mostraram separação entre os isolados de amendoim e de trigo para quibe, bem como uma pequena diferenciação entre isolados de A. flavus aflatoxigênicos e não aflatoxigênicos. Os óleos essenciais de orégano e tomilho a 100% tiveram as maiores médias dos halos de inibição do crescimento dos isolados. Os óleos de canela e erva-doce também foram muito eficientes, mas o óleo de lavanda foi pouco eficiente na inibição do crescimento dos isolados. O efeito do óleo de orégano a 100% ou a 75% não foi estatisticamente diferente, o óleo de tomilho foi mais eficiente a 100%. A concentração mínima que causou inibição do crescimento foi de 25% para o óleo de orégano e 50% para o óleo de tomilho. Conclusões: Foram obtidos 11 isolados de A. flavus e um de A. caelatus de grãos de amendoim do sul do Brasil. Oito dos isolados de A. flavus eram aflatoxigênicos. Não houve diferença filogenética entre os isolados de A. flavus. As análises de RAPD e ISSR mostraram que os isolados de A. flavus obtidos neste trabalho foram parcialmente separados de isolados de A. flavus obtidos previamente de trigo para quibe, indicando diferente colonização de A. flavus nestes hospedeiros. Por fim, os óleos essenciais de orégano, tomilho, canela e erva-doce inibiram o crescimento micelial dos isolados de A. flavus testados.

Abstract: Introduction: Mycotoxins are secondary metabolites produced by fungi. Aflatoxins aremycotoxins that are hepatotoxic, mutagenic, and carcinogenic. There are four types ofaflatoxins named B1, B2, G1, and G2. The species Aspergillus flavus produces aflatoxins, butonly 40-50% of the isolates of this species can produce these mycotoxins, and they can onlyproduce the aflatoxins B1 and B2. It is still not well known why some strains of A. flavusproduce aflatoxins, and others do not. The species A. flavus can contaminate peanut grains.The use of natural preservatives, such as essential oils, is an option for the control of food contamination. Objectives: To evaluate the presence and to obtain isolates of A. flavus on raw peanut kernels commercialized in the city of Maringá, Paraná, Brazil; to identify the isolates at a species level by DNA barcoding; to evaluate the aflatoxin production profile of the obtained isolates by culture medium and chromatographic techniques; to investigate the genetic variability of the isolates, and; to analyze the antifungal effects of five essential oils on some of those isolates. Materials and methods: Initially, peanut samples were bought in stores of the city of Maringá, and kernels from each sample were placed on a solid culture medium, specific for the growth of Aspergillus spp. Peanut kernels contaminated with Aspergillus spp. were counted, and monosporic isolations were performed to obtain the isolates. The monosporic isolates were identified by morphological characterization and DNA barcoding. The ability of the isolates to produce aflatoxins was tested by culture in coconut milk agar, hydroxide vapor exposure, and thin-layer chromatography (TLC). A phylogenetic analysis was carried out with amplification and sequencing of the ITS-5.8rDNA region and a B-tubulin gene region. The genetic variability was studied with PCR reactions using eight primers of RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) and three of ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) with the 11 isolates obtained in this work and with four A. flavus isolates obtained from bulgur wheat in a previous study. The growth inhibition activity of essential oils, pure and diluted, was tested on some of the isolates. Results and discussion: Eleven monosporic isolates of A. flavus and one of Aspergillus caelatus were obtained. Five isolates of A. flavus were identified as aflatoxigenic in culture medium and eight in the TLC analysis, in which the production of B1 and B2 aflatoxins was identified. In the phylogenetic analyses, only the A. caelatus isolate (UEM 4-1) did not group with the A. flavus isolates, which were phylogenetically identical. The RAPD and ISSR analysis showed separation between the peanut and bulgur wheat isolates, as well as a small separation between aflatoxigenic and non-aflatoxigenic A. flavus isolates. The oregano and thyme essential oils at 100% had the highest averages of growth inhibition halos. Fennel and cinnamon essential oils also showed considerable activity on growth inhibition, but the lavender essential oil was the least effective as a growth inhibitor. The effect of oregano oil at 100% or 75% was not statistically different, and thyme oil was most effective at 100%. The minimal concentration to cause growth inhibition was 25% for oregano oil, and 50% for thyme oil. Conclusions: Eleven isolates of A. flavus and one of A. caelatus were obtained from peanut kernels from the South of Brazil. Eight of the A. flavus isolates were aflatoxigenic. Analyses of RAPD and ISSR have shown that most of the A. flavus isolates obtained in this work were partially separated from the A. flavus isolates obtained previously from bulgur wheat, indicating different A. flavus colonization in these hosts. At last, the essential oils of oregano, thyme, cinnamon, and fennel could inhibit the mycelial growth of selected A. flavus isolates.