Morte celular induzida pelas substâncias RCC, C5 e A11K3 em protozoários parasitas Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi

Abstract

Resumo: INTRODUÇÃO: As doenças negligenciadas são um grupo de doenças infecciosas que afetam principalmente populações de baixa renda e em países em desenvolvimento. Dentre elas podemos citar: a leishmaniose, um complexo de doenças causada por protozoários parasitos do gênero Leishmania; e a doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. O tratamento para ambas as doenças é extremamente limitado, pois os medicamentos disponíveis causam diversos efeitos colaterais nos pacientes. Visto a necessidade de novas alternativas de tratamento, o presente estudo avaliou a atividade de dois ?-carbonilicos, RCC e C5 contra L. amazonensis, causador da leishmaniose cutânea e uma dibenzilidenoacetona, A11K3, em T. cruzi. Trabalhos anteriores demonstraram atividade biológica desses grupos de substâncias contra protozoários, bactérias e células tumorais. METODOLOGIA, RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os B-carbonílicos RCC (N-{2-[(4,6-bis(isopropilamino)-1,3,5-triazina-2-yl)amino]etil}-1-(4-metoxiphenil)-B-carbolina-3-carboxamida) e C5 (N-benzyl-1-(4-metoxi)fenil-9H-beta-carbolina-3-carboxamida) foram sintetizados pelo grupo da professora Maria Helena Sarragiotto do Departamento de Química da Universidade Estadual de Maringá e testadas frente à amastigotas intracelulares de L. amazonesis. Para isso, macrófagos J774A.1 foram infectados com promastigotas e após 24 h tratados e incubados por 48 h. Após, as amostras foram fixadas, coradas e a concentração inibitória para 50% (CI50) dos protozoários foi determinada. As substâncias RCC e C5 foram ativas CI50 de 1,2 ± 0,2 e 1,0 ± 0,3 uM, respectivamente. A citotoxicidade foi analisada pelo método de redução do 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) com macrófagos J774A1. As concentrações citotóxicas (CC50) foram de 145,7 ± 10,1 e >1000 uM para o RCC e C5, respectivamente. As substâncias apresentaram atividade em formas amastigotas e baixa toxicidade em macrófagos, sendo que, a substância RCC apresentou um índice de seletividade (IS) de 97,1 e o C5 de >1000, ou seja, os compostos são mais tóxicos para o protozoário que para os macrófagos. A imagens de MET (Microscopia Eletrônica de Transmissão) e a MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura) obtidas em amastigotas intracelulares de L. amazonensis tratadas com a CI50 de RCC e C5 mostram que ocorreu uma diminuição na quantidade de amastigotas intracelulares em macrófagos infectados quando comparado ao controle não tratado, sendo possível a visualização de vacúolos parasitoforos completamente vazios. As amastigotas tratadas apresentaram alterações estruturais como inchaço mitocondrial, desorganização celular e formação de vacúolos. Ainda foram realizados os ensaios bioquímicos para avaliar e analisar os alvos dos B-carbonílicos em amastigotas intracelulares. Com 48 h de tratamento foi possível observar um aumento de corpos lipídicos, vacúolos autofágicos, despolarização mitocondrial seguido de diminuição na produção de ATP e exposição da fosfatidilserina (RCC). Não ocorreu geração de espécies reativas de oxigênio (EROS) em nenhum tratamento, porém a geração de EROS pode ocorrer nas primeiras horas de tratamento, sendo as demais alterações decorrentes do estresse oxidativo. Dessa forma, foi possível concluir que o protozoário não prolifera devido a eventos autofágicos. Quanto aos resultados utilizando T. cruzi, foi utilizada a substância A11K3 ((E)-3-ethyl-4-(4-nitrofenil)but-3-en-2-ona) sintetizada pelo professor Edson Rodrigues Filho do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos. Foram avaliadas as formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas de T.cruzi (cepa Y). A atividade antiproliferativa em epimastigotas foi realizada pelo método XTT/PMS (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5-carboxanilida e metilfeenazina metil sulfato) e a CI50 obtida foi de 3,3 ± 0,8 ?M. As formas tripomastigotas foram coletadas do sobrenadante de células LLCMK2 previamente infectadas e utilizadas para o experimento de viabilidade celular. Para isso, os tripomastigotas foram tratados com A11K3 e a concentração efetiva (CE50) foi determinada realizando a contagem dos protozoários viáveis em lâmina/lamínula onde o valor encontrado foi de 24,0 ± 4,3 uM. Para análise antiproliferativa de amastigotas intracelulares, células LLCMK2 foram infectadas com tripomastigotas e tratadas com A11K3. Após 96 h de incubação, as amostras foram fixadas coradas e a CI50 determinada foi de 9,2 ± 0,6 uM. A CC50 de A11K3 para células LLCMK2, determinada pelo método de redução de MTT foi de 239,3 ± 15,7 uM. Com esses valores foi possível calcular o IS para as três formas tratadas com a substância A11K3. Para epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas intracelulares os IS foram de 72,5, 9,9 e 25,3, respectivamente. A análise ultraestrutural de epimastigotas tratadas com A11K3 sugere um aumento na vacuolização, excreção de vesículas derivadas com complexo de Golgi, surgimento de membranas concêntricas, alterações de membrana e aumento de corpos lipídicos. Através da MEV foi possível observar epimastigotas com dois flagelos, arredondamento do protozoário e extravasamento de material citoplasmático. Em amastigotas intracelulares tratadas com A11K3, os resultados de MET mostraram aumento de vacuolização e excreção nas vesículas do complexo de Golgi, inchaço mitocondrial e ruptura de membrana. Os resultados encontrados durante a microscopia foram confirmados com a análise bioquímica do parasito. O tratamento de A11K3 em epimastigotas gerou alterações de membrana, confirmada pela análise com iodeto de propídeo, possivelmente causada pela produção de EROS e peroxidação lipídica. Além disso, o tratamento com A11K3 ocasionou despolarização de membrana mitocondrial, e consequentemente a diminuição de ATP intracelular. O surgimento de membranas concêntricas é geralmente precursora de vacúolos autofágicos, alteração essa confirmada pela análise com monodancilcadaverina. A análise em amastigotas intracelulares revelou alterações semelhantes ao encontrado em epimastigotas como o surgimento de vacúolos, aumento na excreção de vesículas do complexo de Golgi e ruptura de membrana. Foi possível ainda observar o inchaço mitocondrial em amastigota. Os vacúolos encontrados podem ser corpos lipídicos, devido ao aumento na fluorescência em amastigotas marcadas com vermelho do Nilo. Os resultados sugerem eventos semelhantes à uma morte celular programada, a ferroptose, semelhante à necrose, pois gera alterações de membrana plasmática, membrana mitocondrial e peroxidação lipídica. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS: As substâncias RCC, C5 e A11K3 foram ativas e seletivas contra as amastigotas intracelulares de L. amazonensis e T.cruzi; Através de microscopia eletrônica e os ensaios bioquímicos foi observado que os B-carbonílicos, RCC e C5, afetam a mitocôndria e a formação de vesículas lipídica e/ou autofágicas, ou seja, o tratamento leva os protozoários a um estresse onde ocorre o acúmulo de reservas de energia (formação de corpos lipídicos) e geração de vacúolos com origem autofágica; O T. cruzi tratado com a substância A11K3 mostrou alterações celulares que leva o parasito à morte. Os dados sugerem que tal morte de T. cruzi pode ser semelhante à ferroptose. No período de doutorado sanduiche foram realizados experimentos para geração de uma cepa fluorescente de T. cruzi. A marcação fluorescente foi realizada através da inserção de plasmídeos bacterianos em formas epimastigotas de T. cruzi. Esse protozoário gerado poderá auxiliar projetos futuros no Laboratório de Inovação Tecnológica no Desenvolvimento de Fármacos e Cosméticos.

Abstract: INTRODUCTION: Neglected diseases are a group of infectious diseases that mainly affect poor and vulnerable populations. These include leishmaniasis, a disease complex caused by protozoa parasites of the genus Leishmania; and Chagas disease, caused by the protozoa Trypanosoma cruzi. Treatments for both diseases are extremely limited, as the drugs available have various side effects in patients and their effectiveness are limited. Given the need for new treatment alternatives, the present study sought to evaluate the activity of two B-carbonyls, RCC and C5 against L. amazonensis, which causes cutaneous leishmaniasis and a dibenzylidenoacetone, A11K3, against T. cruzi. Previous work has shown biological activity of these groups of substances against protozoa, bacteria and tumor cells. METHODOLOGY, RESULTS AND DISCUSSION: The B- carbonyl RCC (N- {2 - [(4,6-bis (isopropylamino) -1,3,5-triazin-2-yl) amino] ethyl} -1- (4- methoxyphenyl) -B-carboline-3-carboxamide) and C5 (N-benzyl-1- (4-methoxy) phenyl-9H-beta-carboline-3-carboxamide) were synthesized by Professor Maria Helena Sarragiotto group from the Department of Chemistry of Maringá State University and tested against intracellular amastigotes of L. amazonesis. For this, J774A.1 macrophage were infected with promastigotes, treated and incubated for 48 h. After that, the samples were fixed, stained and the IC50 obtained for RCC and C5 substances were IC50 of 1.2 ± 0.2 and 1.0 ± 0.3 uM, respectively. Cytotoxicity assay were performed by the method of 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT) at a concentration of 2 mg/mL in treated and incubated J774A1 macrophages for 48 h. The CC50 were 145.7 ± 10.1 and > 1000 ?M for RCC and C5, respectively. The substances showed activity against amastigote forms and low toxicity in macrophages. RCC substance showed a selectivity index (IS) of 97.1 and C5 of >1000 ?M, that is, the compounds are more toxic for protozoan than for the mammal cells. TEM and SEM performed on L. amazonenses amastigotes treated for 48 h with the IC50 of RCC and C5 showed that occur a decrease in the amount of intracellular amastigotes in infected macrophages when compared to untreated parasites, allowing the visualization of completely empty vacuoles. The amastigotes presented alterations such as mitochondrial swelling, cellular disorganization and vacuole formation. Biochemical assays were also performed to evaluate and analyze the targets of ?-carboniles in intracellular amastigotes. After 48 h of treatment it was possible to observe an increase in lipid bodies, autophagic vacuoles, mitochondrial depolarization followed by a decrease in ATP production and phosphatidylserine exposure (RCC). No reactive oxygen species (ROS) generation occurred in any treatment. Based on the results, it was possible to conclude that the protozoan did not proliferate due to autophagic events. The substance A11K3 ((E) -3-ethyl-4- (4- nitrophenyl) but-3-en-2-one) was synthesized by Professor Edson Rodrigues of the Department of Chemistry, Universidade Federal de São Carlos. A11K3 were evaluated against epimastigote, trypomastigote and amastigotes forms of T. cruzi (Y strain). For epimastigote analysis, protozoa were treated with A11K3 and incubated for 96 h at 28°C. Then, 50 ?L of 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide solution and methylphenazinium methyl sulfate (XTT / PMS) was added at a concentration of 0.5 and 0.3 mg/mL, respectively and incubated for 4 h. The Reading was performed by spectrophotometer at 450 nm and the IC50 determined IC50 was 3.3 ± 0.8 ?M. Trypomastigotes were collected from the supernatant of previously infected LLCMK2 cells and used for cell viability assay. For this, trypomastigotes were treated with A11K3 and incubated for 24 h. The EC50 was determined by direct parasite counting where the value found was 24.0 ± 4.3 uM. For antiproliferative analysis of intracelular amastigotes, LLCMK2 cells were infected with trypomastigotes and then treated with A11K3. After 96 h of incubation, the samples were fixed, stained and 50% inhibitory concentration (IC50) was 9.2 ± 0.6 ?M. Cytotoxicity in LLCMK2 cells was evaluated by the MTT method and the CC50 was 239.3 ± 15.7 ?M. With these values it was possible to calculate the IS for the three forms treated with substance A11K3. For epimastigotes, trypomastigotes and intracellular amastigotes the IS were 72.5, 9.9 and 25.3, respectively. Ultrastructural analysis of epimastigotes of T. cruzi treated with A11K3 suggest na increase in vacuolization, Golgi complex vesicle excretion, appearance of concentric membranes, membrane alterations, and increase of lipid bodies. Through SEM it was possible to observe epimastigotes with two flagella, protozoa with rounded body and extravasation of cytoplasmic material. TEM of intracellular amastigotes treated with A11K3 showed increased vacuolization and excretion in Golgi complex vesicles, mitochondrial swelling and membrane rupture. The results found during microscopy were confirmed with the biochemical analysis of the parasite. The treatment with A11K3 in epimastigotes generated membrane changes, confirmed by propidium iodide analysis, possibly caused by ROS production and lipid peroxidation. In addition, A11K3 treatment induced mitochondrial membrane depolarization, which decreased the intracellular ATP level. The emergence of concentric membranes is usually a precursor of autophagic vacuoles, as confirmed by monodancylcadaverine assay. Analysis in intracelular amastigotes revealed changes similar to those found in epimastigotes such as the emergence of vacuoles, increased excretion of Golgi vesicles and membrane rupture. In addition, it was possible to observe mitochondrial swelling in amastigotes. The vacuoles found may be lipid bodies as it was observed an increase in fluorescence in amastigotes labeled with Nile red. The results suggest events similar to a programmed cell death, ferroptosis, similar to necrosis, as generates changes in the plasma membrane, mitochondrial membrane and lipid peroxidation. CONCLUSION AND PERSPECTIVES: RCC, C5 and A11K3 were active and selective against the intracellular amastigotes of L. amazonensis and T. cruzi; through electron microscopy and biochemical assays it was observed that the u-carbonyls, RCC and C5, affect the mitochondria and the formation of lipid bodies and autophagic vesicles. The treatment leads the protozoa to a stress where the accumulation of energy reserves (formation of lipid bodies) and generation of vacuoles with autophagic origin; T. cruzi treated with A11K3 substance showed cellular changes that lead the parasite to programmed cell death known as ferroptosis. During the sandwich doctorate period, assays were performed in order to generate a fluorescent strain of T. cruzi. Fluorescent labeling was performed by inserting bacterial plasmids into epimastigotes T. cruzi. This protozoan may help future projects in infection control in vitro and in vivo studies.