Matriz nuclear associada aos segmentos de DNA bent e não bent identificados nas origens de replicação em células de hamster chinês

Abstract

Resumo: Na busca pela elucidação dos mecanismos que envolvem o crescimento, divisão, e os fatores regulatórios do ciclo celular em eucariotos, muitos estudos apontam estruturas e moléculas que podem estar intimamente relacionadas aos processos de replicação e reparo do DNA, bem como direcionam sua proliferação ordenada ou não, como nos casos de carcinogêneses. O câncer é um grupo de doenças caracterizadas pelo crescimento incontrolável e propagação anormal de células, segundo a estimativa do INCA para o biênio 2018-2019, devem ocorrer 600 mil novos casos de câncer, para cada ano no Brasil. Um possível biomarcador para células tumorais é a matriz nuclear, alterações de suas proteínas já foram identificadas em câncer de bexiga, colon, fígado e soro de pacientes. A matriz nuclear corresponde a estrutura proteica residual do núcleo, obtida através de tratamentos bioquímicos para remoção quase total de DNA, RNA e demais componentes celulares. In vivo, a matriz nuclear é descrita como responsável por ordenar a funcionalidade do núcleo, principalmente nos processos de replicação e transcrição do DNA, na arquitetura do núcleo, principalmente na organização do DNA, onde a molécula interage com regiões específicas de ancoramento, denominadas MARs (Matrix Attachment Regions), permitindo formação de loops de DNA, que foram classificados como estruturas operacionais facultativas durante a replicação. Alguns elementos estruturais, como DNA intrinsicamente curvo ou DNA bent, foram relacionadas as regiões S/MARs, devido suas características em comum, principalmente pela sequência rica nas bases adenina (A) e timina (T). Estudo anteriores apontam a interação da matriz nuclear com trechos de DNA bent próximos ou associados às origens de replicação. Um modelo para este estudo foi identificado no domínio do gene que codifica a enzima Adenilato deaminase 2, AMPD2, em linhagens de células transformadas, denominadas GMA32, originadas de fibroblastos de pulmão de hamster Chinês, as quais apresentaram uma superprodução do gene AMPD2, após tratamento com drogas antineoplásicas. Neste domínio estão presentes os genes GNAI3, GNAT2, AMPD2 e GSTM4. Entre os genes GNAI3 e GNAT2, foi descrito uma região preferencial para a iniciação da replicação, a oriGNAI3. Outras origens potenciais são ativadas (oriC, oriB e oriA) nesse segmento, quando a eficiência de iniciação da oriGNAI3 é diminuída por modificação da cromatina na região. Os segmentos de DNA bent (b) e não-bent (nb) foram determinados por análises computacionais, que identificaram trechos com curvatura intrínseca da molécula (bent), enquanto outros trechos, não-bent, foram incapazes de apresentar tal característica, presentes no domínio contendo o gene AMPD2, os quais foram mapeados e selecionados para a análise deste trabalho. Os resultados obtidos demonstram uma interação dinâmica e significativa com as origens de replicação à estrutura da matriz nuclear e sua fração loop, considerando para a análise no segmento preferencial para replicação, a oriGNAI3, as regiões b2 e nb7, com detecção equitativa nas amostras de matriz nuclear e loop. Na origem oriC, os segmentos bent b4a e b4b, apresentam interações, sendo uma banda de maior intensidade na fração loop do b4b, enquanto para as duas frações não-bent, nb10 e nb11, analisadas nessa região, se apresentaram fortemente ligadas à matriz nuclear, embora a fração nb10 está localizada fora do local atribuída à oriC. Foi observado na origem de replicação oriB, uma caracterização de associação à matriz nuclear bem distinta, das três regiões não-bent, nb1, nb2 e nb3, apenas a nb1 não está associada à matriz nuclear. De duas frações intrinsicamente bent analisadas, b5 e b6, as duas estão associadas intensamente à matriz nuclear, embora a fração b6 esteja à aproximadamente 2.700 pb à jusante da oriB. Esta tese fornece resultados inéditos de caracterização de DNA bent e não-bent associado à matriz nuclear in vivo, em segmentos portadores de origens de replicação do DNA, oriGNAI3, oriC e oriB identificadas no domínio contendo o gene AMPD2, em células GMA32, contribuindo desta forma para uma melhor compreensão dessas estruturas em sítios detectados como de atividade de iniciação da replicação em mamíferos.

Abstract: In the search for elucidation of the mechanisms that involve the growth, division, and regulatory factors of the cell cycle in eukaryotes, many studies propose to structures and molecules that may be closely related to DNA replication and repair processes, as well as directing their ordered proliferation or not, as in cases of carcinogenesis. Cancer is a group of diseases characterized by uncontrollable growth and abnormal cell spread, according to INCA estimates for the 2018-2019 biennium, there should be 600,000 new cases of cancer each year in Brazil. A possible biomarker for tumor cells is the nuclear matrix, changes in their proteins have already been identified in bladder, colon, liver and patient serum. The nuclear matrix corresponds to the residual protein structure of the nucleus, obtained through biochemical treatments for almost total removal of DNA, RNA and other cellular components. In vivo, the nuclear matrix is described as responsible for ordering the nucleus functionality, especially in DNA replication and transcription processes, in the nucleus architecture, mainly in DNA organization, where the molecule interacts with specific anchoring regions, called MARs (Matrix Attachment Regions), allowing the formation of DNA loops, which were classified as facultative operational structures during replication. Some structural elements, such as intrinsically curved DNA or bent DNA, were related to the S / MARs regions, due to their common characteristics, mainly by the base rich sequence adenine (A) and thymine (T). Previous studies point to the interaction of the nuclear matrix with stretches of bent DNA close to or associated with the origins of replication. A model for this study was identified in the domain of the gene encoding the enzyme adenylate deaminase 2, AMPD2, in transformed cell lines, called GMA32, originating from Chinese hamster lung fibroblasts, which had an overproduction of the AMPD2 gene after treatment with antineoplastic drugs. In this domain the genes GNAI3, GNAT2, AMPD2 and GSTM4 are present. Among the GNAI3 and GNAT2 genes, a preferential region for initiation of replication, oriGNAI3, has been described. Other potential sources are activated (oriC, oriB and oriA) in this segment when the initiation efficiency of oriGNAI3 is decreased by modifying the chromatin in the region. The bent (b) and non-bent (nb) DNA segments were determined by computational analysis, which identified sections with intrinsic bent curvature, while other non-bent segments were unable to show this characteristic, present in the domain containing the AMPD2 gene, which were mapped and selected for the analysis of this work. The results obtained demonstrate a dynamic and significant interaction with the origins of replication to the nuclear matrix structure and its loop fraction, considering for the analysis in the preferential segment for replication, oriGNAI3, regions b2 and nb7, with equitable detection in the matrix samples nuclear and loop. In the origin oriC, the bent segments b4a and b4b, present interactions, being a band of greater intensity in the loop fraction of b4b, whereas for the two non-bent fractions, nb10 and nb11 analyzed in this region, they were strongly linked to the nuclear matrix, although the fraction nb10 is located outside the site attributed to oriC. It was observed in the origin of replication oriB, a characterization of association to the very distinct nuclear matrix, of the three non-bent regions, nb1, nb2 and nb3, only nb1 is not associated to the nuclear matrix. Of two intrinsically bent fractions analyzed, b5 and b6, the two are strongly associated to the nuclear matrix, although fraction b6 is at approximately 2,700 bp downstream of oriB. This thesis provides unpublished results of bent and non-bent DNA characterization associated with the nuclear matrix in vivo, in segments bearing origin of DNA replication, oriGNAI3, oriC and oriB identified in the domain containing the AMPD2 gene in GMA32 cells form for a better understanding of these structures at sites detected as mammalian initiation of replication.