Metodologias moleculares na identificação de Leishmania braziliensis e na discriminação das principais espécies de Leishmania spp.

Abstract

RESUMO: Os objetivos deste trabalho foram estudar metodologias moleculares para a identificação de Leishmania braziliensis e para a discriminação das principais espécies de Leishmania spp. Os resultados foram divididos em dois artigos. No primeiro artigo, "Comparação entre a PCR utilizando iniciadores específicos e a reatividade com anticorpos monoclonais para a identificação de isolados de Leishmania braziliensis", dos 29 isolados já identificados por perfil de reatividade com anticorpos monoclonais como L. (V.) braziliensis, 16 (53,33%; IC 95%, 35,59 – 70,46%) foram detectados pela PCR e dos 11 isolados de Leishmania spp. ainda não identificados, 7 (63,63%; IC 95%, 33,64-87,22%) apresentaram a banda de 536 pb. A maior proporção de detecção ocorreu para os isolados do serodema III (87,71%; IC 95%; 46,98-99,29%). Houve baixa concordância entre os métodos biológicos de identificação de Leishmania braziliensis e a PCR, sugerindo uma variabilidade genética entre os isolados de Leishmania braziliensis do Noroeste do Estado do Paraná. No segundo artigo, "Restriction Fragment Length Polimorphism (RFLP)-PCR na identificação das principais espécies de Leishmania spp.", o corte enzimático do fragmento de 110-120 pb da espécie Leishmania braziliensis resultou em fragmentos de 40 e 80 pb com a enzima HaeIII e a EcoRI não cortou o fragmento. Para Leishmania amazonensis a enzima EcoRI cortou o fragmento de 120 pb em dois de 60 pb e a HaeIII não cortou. L. chagasi, teve seu fragmento de 110 pb cortado em bandas de 53 pb e 57 pb com a HaeIII e sem corte com EcoRI. T. cruzi apresentou perfil semelhante ao de Leishmania braziliensis. Houve concordância entre os resultados obtidos com a RFLP-PCR usando isolados dos serodemas I, II, III e VII já identificados anteriormente por reatividade com anticorpos monoclonais. Foi possível identificar Leishmania braziliensis em amostras de DNA de escarificação de lesão humana e Leishmania chagasi em amostras de DNA de lesão e sangue de cão. A RFLP-PCR mostrou-se eficaz para a diferenciação das principais espécies de Leishmania

ABSTRACT: The objective was to study molecular methodologies for the identification of Leishmania braziliensis and to discriminate the main species of Leishmania spp. The results were divided into two articles. In the first article, "Comparison of PCR using specific primers and reactivity with monoclonal antibodies for identification of isolates of Leishmania braziliensis," the 29 isolates previously identified by profile of reactivity with monoclonal antibodies as L. (V.) braziliensis, 16 (53.33%, 95% CI, 35.59 to 70.46%) were detected by PCR and 11 strains of Leishmania spp. yet unidentified, 7 (63.63%, 95% CI, 33.64 to 87.22%) showed the band of 536 pb. The higher proportion of detection occurred for the isolates from serodeme III (87.71%, 95% CI, 46.98 to 99.29%). There was low agreement between the biological methods of identification of Leishmania braziliensis and PCR, suggesting a genetic variability among isolates of Leishmania braziliensis from the Northwest of Paraná State. In the second article, "Restriction fragment length polymorphism (RFLP)- PCR to identify the main species of Leishmania spp." The cutting enzyme fragment of 110 pb-120 Leishmania braziliensis resulted in fragments of 40 and 80 pb with the enzyme HaeIII and the EcoRI does not cut the fragment. For Leishmania amazonensis the enzyme EcoRI cut fragment of 120 pb in two of 60 pb and the HaeIII not cut it. L. chagasi, had its fragment of 110 pb cut in bands of 53 pb and 57 pb with HaeIII and blunt with EcoRI. T. cruzi presented a profile similar to Leishmania braziliensis. There was agreement between results obtained with the RFLP-PCR using isolated from serodeme I, II, III and VII have been identified previously by reactivity with monoclonal antibodies. It was possible to identify Leishmania braziliensis in DNA samples of human scarification injury and Leishmania chagasi in DNA samples from lesions and blood of dog. The RFLP-PCR was effective for the differentiation of the main species of Leishmania