Análise do polimorfismo do fragmento de restrição da subunidade 2 da Citocromo Oxidase como marcador molecular para diferenciar Trypanosoma cruzi de Trypanosoma rangeli

Abstract

RESUMO: Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli são protozoários parasitos que infectam diferentes espécies de mamíferos silvestres e domésticos incluindo o homem, sendo transmitidos por triatomíneos. Estes dois parasitos compartilham as mesmas espécies de reservatórios e vetores, dificultando o diagnóstico específico da doença de Chagas. O objetivo do estudo foi verificar o potencial do polimorfismo do tamanho de fragmento de restrição da subunidade 2 do gene mitocondrial Citocromo Oxidase (RFLP-COII) para diferenciar T. cruzi de T. rangeli. Foram utilizados amostras referência das 6 Unidades de Tipagem Distintas (DTU) de T. cruzi e 17 amostras de T. rangeli KP1+ e KP1- isolados de diferentes regiões da América latina. O RFLP-COII foi capaz de separar claramente T. cruzi de T. rangeli, diferenciando também as 6 DTU de T. cruzi, gerando bandas que variaram de aproximadamente 250 pb a 350 pb e uma banda de aproximadamente 80 pb específica para este parasito. T. rangeli do grupo genético KP1+ mostrou bandas de aproximadamente 120 pb e 280 pb, enquanto KP1- gerou um único produto de aproximadamente 400 pb. Além disso, nenhum produto de amplificação foi observado quando o DNA de Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis, Leishmania chagasi, Trypanosoma evansi e Trypanosoma vivax foram testados, indicando que este marcador é específico para T. cruzi e T. rangeli. Ao comparar este marcador com a reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex que separa T. cruzi de T. rangeli e outra multiplex PCR que diferencia os grupos de T. rangeli, o RFLP- COII se mostrou um marcador simples e com melhor poder discriminatório para diferenciar T. cruzi de T. rangeli e os grandes grupos destes parasitos

ABSTRACT: Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli are protozoan parasites that infect several wild and domestic mammalian species, including humans and are transmitted by triatomines. These two parasites share the same reservoirs and vectors, making difficult the specific diagnosis of Chagas disease. The aim of this study was to assess the potential of the of restriction fragment length polymorphism of subunit 2 of the mitochondrial gene of cytochrome oxidase (RFLP-COII) to differentiate T. cruzi from T. rangeli. We used 6 reference samples of Discrete Typing Units (DTU) of T. cruzi and 17 samples of T. rangeli KP1+ and KP1- isolated from different regions in Latin America. The RFLP-COII was able to clearly differentiate T. cruzi from T. rangeli, differentiating also the 6 DTU of T. cruzi, producing bands ranging from approximately 250 bp and 350 bp and a band of approximately 80 bp specific for this parasite. The genetic group T. rangeli KP1+ showed bands of approximately 120 bp and 280 bp and KP1- generated a single product of approximately 400 bp. Moreover, no amplification product was observed when DNA from Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis, Leishmania chagasi, Trypanosoma evansi e Trypanosoma vivax were tested, indicating that this marker is specific for T. cruzi and T. rangeli. A comparison of this marker with polymerase chain reaction (PCR) multiplex that differentiates the T. rangeli major groups proved that RLFP-COII is a simple marker and powerful method to differentiate T. cruzi from T. rangeli and also discriminate between their major genetic groups