Avanços no diagnóstico das leishmanioses : o FTATM card para coleta e preservação de amostras e a PCR em tempo real para detecção e identificação de Leishmania

Abstract

RESUMO: A leishmaniose é uma doença negligenciada e infecciosa, causada por protozoários do gênero Leishmania. Mais de 20 espécies já foram descritas como agentes de diferentes formas da doença no homem. Os objetivos desse estudo foram: realizar a PCR convencional em amostras de raspado de lesão humana coletadas em FTATM card, para pesquisa de Leishmania, e comparar com os métodos de diagnóstico padrão-ouro; padronizar um ensaio de PCR em tempo real para a identificação das espécies pela análise da melting curve; e, por último, apresentar um relato de caso de dois pacientes com leishmaniose tegumentar americana (LTA) que tiveram a lesão estimulada por um trauma local. Raspado de lesões de 48 pacientes foram coletados em microtubo e em FTATM card; os primers LRIB-F e LRIB-R que amplificam 167-pb do 18S rRNA gene da Leishmania foram desenhados de acordo com sequências depositadas no GenBank, e o DNA de dez cepas de Leishmania foi utilizado para a padronização do estudo. A PCR com FTATM card mostrou sensibilidade de 100% quando comparada à microscopia e à PCR em material de lesão coletado em microtubo; o FTATM card teve a capacidade de preservar o DNA equivalente a três promastigotas de L. (V.) braziliensis. Utilizando os primers LRIB-F e LRIB-R, foi possível diferenciar os subgêneros Viannia e Leishmania, e construir uma escala de temperatura para identificação de espécies, de acordo com as diferentes melting temperature obtidas. Dois pacientes com LTA desenvolveram lesão cutânea por estímulo de um trauma corporal local provocado pelo uso de sonda nasogástrica (Caso 1), e cirurgia no joelho seguida de choque mecânico em acidente de carro (Caso 2). O FTATM card é uma boa alternativa e pode ser utilizado para o armazenamento de material de escarificação de lesão para pesquisa de Leishmania. Os primers LRIB-F e LRIB-R apresentaram alta sensibilidade e eficiência para detecção e identificação de espécies de Leishmania. Os casos de LTA relatados foram semelhantes ao conceito de que os parasitos tendem a se estabelecerem em regiões corporais de resistência diminuída

ABSTRACT: Leishmaniases are neglected infectious diseases caused by protozoa belonging to the Leishmania genus. More than 20 species have been described causing different forms of the disease in the humans. The objectives of this study were: to perform the conventional PCR in human lesion scraping samples collected in FTATM card for Leishmania research, and compare with gold standard diagnostic methods; to standardize a Real-Time PCR assay for species identification through the melting curve analysis; and lastly, to present a case report of two patients with American tegumentary leishmaniasis (ATL) who had the lesion triggered by local trauma. Scraped lesions of 48 patients were collected in microtube and FTATM card; the LRIB-F and LRIB-R primers that amplify 167-bp of Leishmania 18S rRNA gene were designed according to sequences deposited in GenBank, and the DNA from ten Leishmania strains was used for the standardization of the study. The PCR in FTATM card showed a sensitivity of 100% when compared to microscopy and PCR in lesion material collected in microtube; and, the FTATM card had the ability to preserve DNA equivalent to three promastigotes of L. (V.) braziliensis. It was possible to differentiate Viannia and Leishmania subgenera, and, by the use of LRIB-F and LRIB-R primers, to construct a temperature scale for species identification, according to the different melting temperature. We showed that two patients with ATL developed cutaneous lesions by the stimulus of a local trauma, caused by the use of a nasogastric tube (Case 1) and a knee surgery followed by mechanical shock in a car accident (Case 2). The FTATM card is a good alternative and can be used for the storage of lesion scarification material for Leishmania research. The LRIB-F and LRIB-R primers presented high sensitivity and efficiency for detection and identification of Leishmania species. The ATL cases reported were in agreement with the concept that parasites tend to settle in body regions of weakened resistance