Resposta jejunal à infecção por Toxoplasma gondii em ratos com cepas diferentes : estudo exploratório da resposta serotoninérgica à infecção aguda e dos efeitos da imunoestimulação pela Echinacea purpurea na infecção crônica

Abstract

RESUMO: O Toxoplasma gondii, agente etiológico da toxoplasmose, tem o ciclo de vida heteroxênico, é membro do filo Apicomplexa e está entre os parasitos de maior transmissão infectando a população humana e diversos animais homeotérmicos. Muitas vezes esta infecção é considerada assintomática, porém a toxoplasmose aguda é caracterizada pela rápida reprodução e disseminação do parasito por todo o corpo do hospedeiro, podendo causar febre, fadiga e dor de cabeça. Quando adquirida durante a gestação pode trazer graves complicações para o feto incluindo malformações e aborto. Geralmente o hospedeiro se infecta através de água ou alimentos contaminados com o parasito que precisa atravessar a parede intestinal para chegar à corrente sanguínea e se disseminar. A presença deste parasito no intestino induz à inflamação local causando a produção de anticorpos e citocinas que recrutam células do sistema imune as quais mobilizam respostas celulares que, muitas vezes, além de neutralizar o parasito, causam danos no próprio hospedeiro. Vários estudos demonstraram que a toxoplasmose modifica o trato gastrointestinal, outros ainda evidenciam que o medicamento utilizado para o tratamento já não faz o efeito necessário. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi analisar a estabilidade da membrana basal, as alterações colágenas e as células que participam do processo inflamatório no jejuno de ratos frente a infecção aguda causada por T. gondii (cepa Me-49), assim como, analisar a dinâmica estrutural da túnica mucosa, tela submucosa e alterações histológicas e histopatológicas das túnicas que compõem o jejuno de ratos inoculados com Toxoplasma gondii (cepa RH) e submetidos a imunoestimulação com Echinacea purpurea na infecção crônica. Os protocolos experimentais foram previamente encaminhados ao Comitê de Conduta Ética no Uso de Animais em Experimentação da Universidade Estadual de Maringá. A pesquisa foi realizada com Rattus norvegicus machos. Para a primeira etapa (infeção aguda) os ratos foram distribuídos em 5 grupos com 7 animais cada. Os ratos infectados receberam 5000 oocistos esporulados de T. gondii (cepa ME 49) ressuspendidos em solução salina enquanto o grupo controle recebeu solução salina estéril. Os ratos foram mortos com 6 horas, 2 dias, 3 dias e 7 dias de infecção, com 60 dias de vida, incluindo o grupo controle. Para a segunda etapa (infecção crônica) os ratos foram distribuídos em 4 grupos com 6 animais cada. Os ratos imunoestimulados receberam 100 mg/kg de Echinacea purpurea por via oral por 28 dias antes e 28 dias depois da data da infecção. Os ratos dos grupos que não foram imunoestimulados receberam água fervida em temperatura ambiente. Os ratos dos grupos infectados receberam por via oral 500 oocistos esporulados de T. gondii (cepa RH) ressuspendidos em solução salina. Os grupos controles receberam solução salina estéril. Antes da morte dos animais (com 94 dias de idade), o sangue foi coletado através da punção retrorbital para a avaliação da soroconversão. Posteriormente a morte de todos os animais os jejunos foram retirados e submetidos à rotina histológica para análise da disposição das fibras colágenas de diferentes tipos, análise de células inflamatórias e demonstrados a membrana basal e células serotoninérgicas através de imunohistoquímica anti-laminina e anti-5HT respectivamente - primeira etapa do experimento. Além das técnicas citadas (exceto imunohistoquímica anti- laminina), para a segunda etapa do experimento foram mensurados os estratos que compõem a parede jejunal, análise de fibras elásticas, quantificação das células caliciformes (CCs), linfócitos intraepiteliais (LIEs) e células de Paneth (CP). Entre os principais achados, na fase aguda, a marcação da laminina por imuno-histoquímica permitiu a visualização de rupturas na membrana basal do jejuno de ratos infectados, que pode danificar as funções locais e afetar todo o sistema de seletividade e homeostase das células intestinais, permitindo maior migração de células imunes para mediar a resposta inflamatória. O número de células enterocromafins e mastócitos positivos para serotonina (5-HT+) aumentaram significativamente, assim como os mastócitos totais em 2, 3 e 7 dias pós-infecção, caracterizando mastocitose. Quanto aos achados nos animais infectados e imunoestimulados na fase crônica, os principais foram: aumento da parede total, túnica muscular e tela submucosa; redução na altura e largura dos vilos e aumento na altura dos enterócitos; redução dos LIEs; aumento na quantidade das CCs, CP e dos colágenos tipo I, III e total. A análise histopatológica mostrou processos inflamatórios nos animais dos grupos infectados. A infecção aguda causada pelo parasito permitiu verificar que houve a transposição do epitélio por T. gondii e ruptura da membrana basal ativando o sistema imunológico local. O aumento no número de mastócitos, sugere que a resposta ao parasito foi altamente regulada e o aumento no número de células 5-HT-IR pode ter tornado a mucosa jejunal um microambiente pró-inflamatório. Com a imunoestimulação na fase crônica, podemos perceber que houve dinâmica de reestruturação tanto da constituição epitelial quanto da lâmina própria refletindo o momento imunológico vivido pelo hospedeiro. A imunoestimulação com E. purpurea mostrou prevenção parcial da atrofia dos vilos e criptas ou em processo de regeneração. Células epiteliais e intra-epiteliais sugerem potencial controle da resposta inflamatória local assim como estímulo para a síntese de colágeno. A infecção aguda por T. gondii permitiu desvendar mais uma etapa da resposta inflamatória do hospedeiro, e a imunoestimulação na infecção crônica mostrou-se eficiente ao organismo hospedeiro, o que pode ser o ínicio de muitas pesquisas relacionadas ao T. gondii X Echinacea purpurea

ABSTRACT: Toxoplasma gondii, the etiologic agent of toxoplasmosis, has a heteroxenic life cycle, is a member of the phylum Apicomplexa, and is among the most transmitted parasites infecting the human population and several homeothermic animals. Many times this infection is considered asymptomatic, but acute toxoplasmosis is characterized by the rapid reproduction and dissemination of the parasite throughout the host's body, which can cause fever, fatigue, and headache. When acquired during pregnancy it can bring serious complications to the fetus including malformations and abortion. The host usually becomes infected through water or food contaminated with the parasite, which needs to pass through the intestinal wall to reach the bloodstream and spread. The presence of this parasite in the intestine induces local inflammation causing the production of antibodies and cytokines that recruit cells of the immune system which mobilize cellular responses that often, in addition to neutralizing the parasite, cause damage to the host itself. Several studies have shown that toxoplasmosis modifies the gastrointestinal tract, while others show that the drug used for the treatment no longer has the necessary effect. Thus, the objective of this study was to analyze the stability of the basement membrane, the collagen changes and the cells that participate in the inflammatory process in the jejunum of rats against acute infection caused by T. gondii (Me-49 strain), as well as to analyze the structural dynamics of the tunica mucosa, submucosa and histological and histopathological alterations of the tunicae that compose the jejunum of mice inoculated with Toxoplasma gondii (RH strain) and submitted to immunostimulation with Echinacea purpurea during chronic infection. The experimental protocols were previously submitted to the Ethical Conduct Committee on the Use of Animals in Experimentation of the State University of Maringá. The research was carried out with male Rattus norvegicus. For the first stage (acute infection) the rats were distributed into 5 groups with 7 animals each. The infected rats received 5000 sporulated oocysts of T. gondii (ME 49 strain) resuspended in saline solution while the control group received sterile saline solution. The mice were killed at 6 hours, 2 days, 3 days and 7 days of infection at 60 days of age, including the control group. For the second stage (chronic infection) the rats were distributed into 4 groups with 6 animals each. The immunostimulated mice received 100 mg/kg Echinacea purpurea orally for 28 days before and 28 days after the infection date. The mice in the non-immunostimulated groups received boiled water at room temperature. The mice in the infected groups received orally 500 sporulated T. gondii oocysts (RH strain) resuspended in saline. The control groups received sterile saline solution. Before the animals died (at 94 days of age), blood was collected through retrorbital puncture to evaluate seroconversion. After the death of all animals the jejunums were removed and submitted to histological routine for analysis of collagen fiber arrangement of different types, analysis of inflammatory cells and demonstrated basal membrane and serotoninergic cells through anti-laminin and anti-5HT immunohistochemistry respectively - the first stage of the experiment. Besides the techniques cited (except anti-laminin immunohistochemistry), for the second stage of the experiment the strata that make up the jejunal wall were measured, elastic fiber analysis, quantification of calyces cells (CCs), intraepithelial lymphocytes (IELs) and Paneth cells (PC). Among the main findings, in the acute phase, laminin labeling by immunohistochemistry allowed the visualization of ruptures in the basement membrane of the jejunum of infected mice, which can damage local functions and affect the whole system of selectivity and homeostasis of intestinal cells, allowing greater migration of immune cells to mediate the inflammatory response. The number of enterochromaffin cells and serotonin positive (5-HT+) mast cells increased significantly, as did total mast cells at 2, 3 and 7 days post-infection, characterizing mastocytosis. As for the findings in the infected and immunostimulated animals in the chronic phase, the main ones were: increase in the total wall, tunica muscularis and submucosa mesh; reduction in the height and width of the villi and increase in the height of the enterocytes; reduction in the LIEs; increase in the quantity of the CCs, PC and type I, III and total collagens. Histopathological analysis showed inflammatory processes in the animals of the infected groups. The acute infection caused by the parasite allowed us to verify that there was a transposition of the epithelium by T. gondii and rupture of the basement membrane activating the local immune system. The increased number of mast cells suggests that the response to the parasite was highly regulated, and the increased number of 5-HT-IR cells may have turned the jejunal mucosa into a pro-inflammatory microenvironment. With immunostimulation in the chronic phase, we can see that there was dynamic restructuring of both the epithelial and lamina propria constitution reflecting the immune momentum experienced by the host. The immunostimulation with E. purpurea showed partial prevention of atrophy of the villi and crypts or in the process of regeneration. Epithelial and intraepithelial cells suggest potential control of the local inflammatory response as well as stimulation for collagen synthesis. The acute infection by T. gondii allowed the unveiling of one more stage of the host inflammatory response, and the immunostimulation in the chronic infection proved to be efficient to the host organism, which can be the beginning of many researches related to T. gondii X Echinacea purpurea