Estudo histopatológico e funcional da resposta inflamatória jejunal a diferentes inóculos de Toxoplasma gondii

Abstract

RESUMO: O Toxoplasma gondii (T. gondii) é um parasito intracelular obrigatório, de ciclo de vida heteroxênico, apresentando os felídeos como hospedeiros definitivos e o homem e demais animais homeotérmicos como hospedeiros intermediários (HI), sendo os roedores os principais (HI). Comumente, a infecção ocorre após a ingestão de água e alimentos contaminados com oocistos ou cistos, contendo esporozoítos e bradizoítos respectivamente. Em contato com o trato gastrointestinal (TGI), a forma de vida taquizoíto, realiza a transposição das barreiras intestinais, alcançando via linfática e sanguínea e consequentemente migrando para locais de afinidade, como o sistema nervoso central e tecido muscular. Entretando, o processo invasivo do parasito, estimula respostas imunológicas e inflamatórias para o local de entrada, podendo ocasionar em alterações no funcionamento adequado do órgão, provocado diretamente pelo parasito ou pela resposta imune e inflamatória desenhem decorrência da infecção. Sabe-se que a dose de inóculo possui influência na resposta do organismo frente ao agente invasor, porém desconhece-se qual inóculo seria capaz de levar a alterações e quais modificações a invasão pelo parasito pode provocar no TGI. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar as alterações morfológicas e no sistema nervoso entérico (SNE), bem como, de marcadores do estresse oxidativo e cascata de apoptose, do jejuno de ratos infectados oralmente com oocistos de T. gondii (cepa ME-49 genótipo II) e ainda a relação com o inóculo. Ratos Wistar, foram randomizados em seis grupos (n=7). Cada grupo recebeu por gavage um inóculo, sendo: G50 (50 oocistos), G100 (100 oocistos), G500 (500 oocistos), G1000 (1000 oocistos) ou G5000 (5.000 oocistos), enquanto que o grupo controle (GC) recebeu solução de salina estéril. O transito gastrointestinal, foi avaliado através da administração oral de corante não absorvível. Sangue, através de punção do plexo retrorbital, foi coletado antes da inoculação e após 30 dias de infecção, para a avaliação da soroconversão e quantificação de leucócitos (LE) sanguíneos. Foram quantificados os LE fecais nos dias 0, 7, 14, 21, 30. Após 30 dias de infecção os animais foram submetidos à eutanásia e o jejuno coletado. Foram avaliados por histoquímica de hematoxilina e eosina (HE) - enterócitos, células de Paneth, linfócitos intraepiteliais (LIE), morfometria da túnica mucosa, tela submucosa, vilos e criptas. As células caliciformes foram quantificadas de acordo com o tipo de mucina produzida, sendo mucinas neutras e lábeis - ácido periódico de Schiff (PAS); sialomucinas - Alcian Blue (AB) pH 2,5; sulfomucinas - AB pH 1,0. O tricômio de Azan foi utilizado para a quantificação das fibras colágenas totais, Picrosirius red - tipificação do colágeno I e III e a quantificação de colágeno solúvel. Por análise imunohistoquímica foram avaliadas as células enteroendócrinas serotoninérgicas (5HT/IR), mastócitos e células em proliferação celular (PCNA). Na avaliação do SNE, foram evidenciados os neurônios totais (NT), metabolicamente ativos (NADH-d+), nitrérgicos (NADPH-d+), calretinina (CARL) e a glia entérica pela marcação das proteínas S100 e GFAP. Analisou-se marcadores mieloperoxidase (MPO), glutationa redutase (GSH), lipoproteína peroxidase (LPO), superóxido desmutase (SOD) e glutationa - S - transferase (GST). Proteínas da cascata de apoptose (BAK, Bcl-2, caspases 3 e 5) e a expressão de TGF-?, foram determinadas por Western blotting foi analisado. Entre os principais achados, foi verificado que os animais dos grupos infectados apresentaram a soroconversão apresentando a infecção. A confirmação também foi realizada pela presença qualitativa de cistos cerebrais. Foram constatadas alterações em LE sanguíneos com elevação de mononucleados mesmo após 30 dias de infecção. Os LE fecais apresentaram-se elevados aos 21 dias de infecção. Interócitos encontraram-se mais alto e com largura reduzida. As células de Paneth umentaram significantemente nos grupos inoculados. A arquitetura jejunal foi alterada endo verificado atrofia de mucosa, submucosa, vilos e criptas. Os LIE aumentaram, bem omo, as células produtoras de sulfomucinas (AB pH 1,0). Foi constatado aumento das élulas em mitose (PCNA), enquanto que as 5HT/IR reduziram e os mastócitos presentaram-se elevados. Houve aumento da área ocupada pelo colágeno evidenciado elo tricômio de Azan, porém com redução do colágeno tipo III demonstrado no icrosirius red e sem modificações significativas entre o colágeno solúvel e tipo I. Os NT o plexo submucoso e NADH-d+ apresentaram redução em número, porém com aumento a expressão da subpopulação neuronal NADPH-d+, que expressam óxido nítrico, possivelmente para a contenção do parasito. A glia entérica no plexo submucoso demonstrou aumento em relação ao número de NT. No plexo submucoso de animais infectados houve redução de neurônios CARL/IR e aumento de células da glia GFAP/IR. Já no plexo mientérico ocorreu aumento do número de neurônios CARL/IR e redução das células da glia GFAP/IR. A infecção provocou aumento de MPO nos grupos com maiores inóculo, significante em G1000. A Bcl-2 reduziu em G500, G1000 e G5000. Observou-se aumento da expressão das proteínas apoptóticas BAK, caspase-3 e na expressão do TGF-? no G5000. Todos os resultados dos animais infectados foram comparados ao GC. Relatamos nossos resultados derivados de um modelo experimental de curva de inóculo de oocistos de T. gondii, demonstrando como a infecção do parasito pode interferir na arquitetura e células do jejuno dos ratos, e ainda, que as alterações foram mais evidêntes nos maiores inóculos. A infecção pelo parasito permitiu verificar a importância do inóculo no desenvolvimento das alterações jejunais, bem como, que o TGI sofre modificações na infecção oral, que permanecem percebidas mesmo na fase crônica da patologia

ABSTRACT: The Toxoplasma gondii (T. gondii) is an obligate intracellular parasite with a heteroxenic life cycle, wich presents felids as definitive hosts and man and other homeothermic animals as intermediary host. Generally, the infection occurs after the ingestion of water and food contaminated with oocysts or cysts containing sporozoites and bradyzoites, respectively. In contact with the gastrointestinal tract (GIT), the tachyzoite form of life transposes the intestinal barriers, reaching the lymphatic and blood pathways and consequently migrating to affinity sites, such as central and muscular nervous tissue. However, the invasive process of the parasite stimulates immunological and inflammatory responses to the site of entry, which may lead to changes in the proper functioning of the organ, caused directly by the parasite or by the immune and inflammatory response triggered by the infection. It is known that the dose of inoculum has an influence on the response of the organism to the invading agent, but it is unknown which dose would be able to lead to changes and what types of modifications the invasion by the parasite can trigger in the GIT. Thus, the objective of this research was to analyze the morphological and enteric nervous system (ENS) alterations, as well as markers of oxidative stress and apoptosis cascade on jejunum of orally infected rats with T. Gondii oocysts (strain ME-49 genotype II) and the relation with the inocula dose. Wistar rats were randomized into six groups (n=7). Each group received a dose of inoculum by gavage: G50 (50 oocysts), G100 (100 oocysts), G500 (500 oocysts), G1000 (1000 oocysts) or G5000 (5,000 oocysts), while control group (GC) received sterile saline solution. Gastrointestinal transit was evaluated by oral administration of nomabsorbable dye. Blood, through puncture of the retrorbital plexus, was collected before inoculation after 30 days of infection, for the evaluation of seroconversion and quantification of blood leukocytes (LE). Fecal LE was quantified on days 0, 7, 14, 21, 30. After 30 days of infection, the animals were submitted to euthanasia and the jejunum collected. Hematoxylin and eosin (HE) histochemistry - enterocytes, Paneth cells, intraepithelial lymphocytes (LIE), tunica mucosa morphometry, submucosal screen, villi and crypts were evaluated. Goblet cells were quantified according to the type of mucin produced, being neutral and labile mucins - periodic acid of Schiff (PAS); sialomucins - Alcian Blue (AB) pH 2.5; sulfomucines - AB pH 1.0. Azan trichrome was used for the quantification of total collagen fibers, Picrosirius red - typing of collagen I and III and quantification of soluble collagen. Immunohistochemical analysis of serotoninergic enteroendocrine (5HT/ IR) cells, mast cells and cell proliferation cells (PCNA) were evaluated. In the evaluation of the SNE, total neurons (NT), metabolically active (NADH-d +), nitrergic (NADPH-d+), calretinin (CARL) and enteric glia were evidenced by the S100 and GFAP proteins. Myeloperoxidase (MPO), glutathione reductase (GSH), lipoprotein peroxidase (LPO), superoxide desmutase (SOD) and glutathione-S-transferase (GST) markers were analyzed. Protein cascade apoptosis (BAK, Bcl-2, caspases 3 and 5) and expression of TGF-? were determined by Western blotting was analyzed. Among the main findings, it was verified that the animals of the infected groups presented the seroconversion leading to infection. The confirmation was also performed by the qualitative presence of cerebral cysts. Changes in blood LE with mononuclear elevation were observed even after 30 days of infection. The fecal LE were elevated after 21 days of infection. Enterocytes were higher and with reduced width. Paneth cells increased significantly in infected groups. The jejunal architecture was changed, with atrophy of the mucosa, submucosa, villi and crypts. LIEs increased as well as sulfomucine-producing cells (AB pH 1.0). It was observed an increase of the cells in mitosis (PCNA), whereas 5HT/IR reduced and the mast cells were elevated. There was an increase in the area occupied by collagen evidenced by Azan trichome with reduction of type III collagen. However, there were no significant changes between soluble and type I collagen. The submucosal plexus TN presented a reduction in number, but with an increase in the expression of the NADPH- d+ neuronal subpopulation, which express nitric oxide, possibly to contain the parasite. The enteric glia in the submucosal plexus showed increase in relation to the TN number. In the submucosal plexus of infected animals there was reduction of CARL/IR neuron and increase of GFAP/IR glia cells. In the myenteric plexus, there was an increase in the number of CARL/IR neurons and a reduction of GFAP/IR glial cells. The infection caused an increase of MPO in the groups with higher doses of inoculum. Bcl-2 reduced in G500, G1000 and G5000. Increased expression of BAK, caspase-3 and TGF-? proteins was observed in G5000. All the results from infected animals were compared to CG. We report our results derived from an experimental dose curve model of T. gondii oocysts, demonstrating how infection of the parasite may interfere with the architecture and cells from the jejunum of rats, and that the alterations were better evaluated with the larger inocula. The infection by the parasite showed the importance of the dose in development of jejunal alterations, as well as the gastrointestinal tract suffers modifications in oral infection, which remain even in the chronic phase of the pathology