Avaliação da atividade e inibição de bombas de efluxo de novos 1,3,4-tiadiazóis derivados do (-)-canfeno em Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Resumo: A tuberculose (TB) é a doença infecciosa que atualmente possui a maior taxa de mortalidade dentre as doenças causadas por um único agente. Esta doença possui um tratamento já bem padronizado e efetivo, com altos índices de cura, quando seguido corretamente. No entanto, o tratamento é de longa duração, muito tóxico ao paciente e também pode ocorrer a resistência bacilar, dificultando a cura e sendo necessária a mudança do tratamento. Um mecanismo conhecido de resistência em Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é através de bombas de efluxo (BE), no qual o bacilo expulsa o fármaco do interior da bactéria, antes que ele atinja o seu alvo. Tendo em vista as dificuldades do tratamento e a resistência de Mtb, o objetivo desse estudo foi avaliar a atividade e a inibição de bomba de efluxo de uma série de 1,3,4-tiadiazóis derivados do (-)-canfeno (TDZ) frente a cepa padrão e isolados clínicos de Mtb, em dois diferentes pHs, bem como avaliar a citotoxicidade dessas substâncias, in vitro. A concentração inibitória mínima (CIM) e a combinação de fármacos foram realizadas pelas técnicas de resazurin microtiter assay plate (REMA) e resazurin drugs combination assay (REDCA), respectivamente; as duas técnicas têm como revelador a resazurina. O ensaio com MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio) foi utilizado para avaliar a citotoxicidade, in vitro, em células VERO e J774A.1. Além disso, foi realizado o ensaio de hemólise em hemácias de carneiro. O experimento de acúmulo de brometo de etídeo foi feito para analisar a inibição de BE. As substâncias (6a, 6c, 6g, 6h e 6j) (CIM 7,8 ?g/mL) e (6b) (CIM 15,6 ?g/mL) apresentaram excelente atividade frente a H37Rv e isolados clínicos, em pH 6,8. Em pH 6,0 os resultados de MIC da cepa padrão apresentaram pequenas variações. A ação combinada dos fármacos com os TDZs, em sua maioria, foi aditiva, no entanto, (6j) demonstrou atividade sinérgica com rifampicina, etambutol e pirazinamida. O índice de seletividade (IS) calculado pelo ensaio de citotoxicidade se mostrou promissor, variando de 8,6 a 30,8 para células VERO; 5,4 a 42,9 para macrófagos J774A.1 e de > 64,1 para hemácias de carneiro. Seis TDZs mostraram inibição de BE em Mtb. Nos estudos in silico, as substâncias apresentaram ótima absorção gastrointestinal e estão em conformidade com todas as regras de Lipinski. Concluímos que seis substâncias da série de TDZs apresentaram resultados promissores frente a Mtb, e podem ser consideradas candidatas a novos fármacos, no entanto, outros estudos precisam ser realizados para o melhor entendimento do mecanismo de ação destas substâncias

Abstract: Tuberculosis (TB) is the infectious disease that currently has the highest mortality rate among diseases caused by a single agent. This disease has an already well-standardized and effective treatment, with high rates of cure, if followed correctly. However, the treatment is time-consuming, very toxic to the patient and bacillary resistance can also occur, making it difficult to cure and requiring treatment change. A well stablished mechanism of resistance in Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is through efflux pumps (EP), in which the bacillus expels the drug from the inside of the bacterium before it reaches its target. Considering the difficulties of treatment and high levels of resistance of Mtb, the objective of this study was to evaluate the activity and EP inhibition of a series of 12 novels (-)-camphene-based 1,3,4-thiadiazoles (TDZ) against Mtb, as well as the in vitro cytotoxicity. The minimum inhibitory concentration (MIC) and drug combination were performed by resazurin microtiter assay plate (REMA) and resazurin drugs combination assay (REDCA), respectively; the two techniques have resazurin as a developer. The MTT assay (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) was used to evaluate cytotoxicity in vitro in VERO and J774A.1 cells. In addition, the hemolysis assay was performed on sheep's red blood cells. The experiment of accumulation of ethidium bromide was done to analyze the inhibition of EP. Compounds (6a, 6c, 6g, 6h, and 6j) (CIM 7.8 ?g/mL) and (6b) (CIM 15.6 ?g/mL) showed excellent activity against H37Rv and clinical isolates at pH 6.8. At pH 6.0, the MIC results of the standard strain showed slight variations. The combined action of the drugs and most TDZs was additive; however, (6j) demonstrated synergistic activity with rifampicin, ethambutol, and pyrazinamide. The selectivity index (SI) calculated by the cytotoxicity assay was promising, ranging from 8.6 to 30.8 for VERO cells; 5.4 to 42.9 for J774A.1 macrophages and > 64.1 for the sheep's red blood cells. Six TDZs showed inhibition of EP in Mtb. The compounds exhibited, at in silico studies, optimal gastrointestinal absorption and conform to all Lipinski's rules. We conclude that six TDZs presented promising results against Mtb, and may be considered candidates for new drugs. However, other studies need to be performed to better understand the mechanism of action of these compounds