Produção da enzima ciclodextrina glicosil transferase de Bacillus firmus cepa 37 em Escherichia coli

Abstract

RESUMO: O amido é um carboidrato polimérico formado por muitas unidades de glicose unidas covalentemente, sendo o principal material de reserva das plantas e a principal fonte de energia na nutrição animal. No grânulo do amido são encontrados dois tipos de polímero de glicose, a amilose e a amilopectina. A amilose é formada por cadeias longas não ramificadas de resíduos de D-glicose unidos por ligação glicosídica ?-(1-4). Já a amilopectina, ao contrário da amilose, é altamente ramificada, sendo a cadeia linear também composta por resíduos de D-glicose unidos por ligação glicosídica ?-(1-4) e ramificações ?-(1-6) a cada 8 a 12 resíduos. Além de sua importância como material de reserva e fonte de energia nutricional, o amido também possui importância industrial devido a seu baixo custo, fácil obtenção por ser natural, além da possibilidade de alterar suas propriedades físico químicas e submetê-lo a reações enzimáticas. Uma das enzimas relacionadas ao objeto de estudo deste trabalho são ?- amilases, endocarboidratases, que agem hidrolisando ligações ?-(1-4) presentes na amilose e na amilopectina, randomicamente na porção central das moléculas. Elas possuem mais afinidade por substratos de maior massa molecular, criando uma mistura de oligossacarídeos de diferentes tamanhos, que podem ser lineares ou ramificados, chamados de dextrina ou maltodextrina. Enzimas amilolíticas são usadas em larga escala e uma dessas enzimas é a CGTase, que vêm ganhando grande destaque devido sua capacidade de realizar ciclização do amido gerando assim as ciclodextrinas. O oligossacarídeo ciclodextrina (CD) possui de 6 a 8 resíduos de glicose unidos por ligação glicosídica ?-(1-4) e compondo um macrociclo em forma de anel. Existem 3 tipos de CDs, que se diferenciam pela quantidade de resíduos de glicose no ciclo: as ?-ciclodextrinas (6 resíduos de glicose), ?-ciclodextrinas (7 resíduos de glicose) e ?-ciclodextrinas (8 resíduos de glicose). Tridimensionalmente, as ciclodextrinas tem um formato de cone cuja face interna possui um caráter apolar e a face externa, polar. Dessa forma, a molécula de CD pode encapsular substâncias em seu interior, causando profundas modificações físico-químicas das mesmas. A substância que forma um composto de inclusão com a CD pode ter sua estabilidade aumentada, diminuição da volatilidade, resistência térmica e contra oxidação, diminuir a hidrólise de compostos lábeis, aumentar a solubilidade de compostos insolúveis, entre outros. Por isso, as CDs têm grande potencial para serem utilizadas industrialmente, com emprego na área de alimentos, cosméticos, tecnologia química, fármacos, pesticidas, entre muitos outros. Devido ao grande interesse comercial no emprego das CDs, as CGTases são bastante estudadas e os pesquisadores da área estão constantemente buscando novas fontes e formas de aumentar o rendimento de sua produção. Essas enzimas são produzidas por várias espécies de bactérias de vida livre encontradas em diversos ambientes diferentes. Anteriormente, através de prospecção de bactérias produtoras de CGTase em solo brasileiro, a bactéria Bacillus firmus cepa 37 foi isolada e identificada como uma boa produtora de CGTase, a qual produz, principalmente, ?-CD. Em estudos prévios, o gene codificador da CGTase desse organismo foi sequenciado, amplificado e clonado para expressão de proteína recombinante em sistema heterólogo de Bacillus subtilis. No entanto, para viabilizar o emprego comercial da CGTase de B. firmus cepa 37, faz-se necessário um sistema de expressão que permita um maior rendimento enzimático. Por isso, no presente trabalho o gene que codifica a CGTase de B. firmus cepa 37 foi clonado em vetor pET29a, que permite a superexpressão da enzima no sistema heterólogo de Escherichia coli. O plasmídeo planejado foi sintetizado por empresa especializada. Uma vez adquirido o plasmídeo, o mesmo foi replicado na estirpe Top10 de E. coli e, para superexpressão de proteínas, transformado na estirpe BL21(DE3), também de E. coli. As células foram crescidas em meio líquido, e a expressão da proteína recombinante foi induzida mediante a adição de Isopropil ?-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), um análogo da lactose. A superexpressão foi confirmada por eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). As células contendo o extrato proteico foram lisadas por sonicação para liberação da enzima superexpressa para o meio extracelular. A atividade de CGTase desse extrato proteico foi avaliada pelo método da complexação da fenolftaleína. Os resultados mostraram que a CGTase foi expressa na forma ativa, tendo sido encontrada uma atividade de 0,12 ?mol CD/mL. O presente trabalho obteve sucesso na obtenção de um sistema de expressão da enzima CGTase de B. firmus cepa 37 em E. coli na sua forma ativa. A proteína produzida dessa forma poderá posteriormente ser purificada até homogeneidade e utilizada para diferentes aplicações industriais

ABSTRACT: Starch is a polymeric carbohydrate formed by many glucose units covalently joined, being the main reserve material of plants and the main source of energy in animal nutrition. Two types of glucose polymers are found in starch granules, amylose and amylopectin. Amylose is formed by long unbranched chains of D-glucose residues joined by an ?-(1-4) glycosidic bond. Amylopectin, unlike amylose, is highly branched, with the linear chain also composed of D-glucose residues joined by an ?-(1-4) glycosidic bond and ?-(1-6) branches every 8 to 12 residues. In addition to its importance as a reserve material and a source of nutritional energy, starch also has industrial importance due to its low cost, easy obtainment because it is natural, in addition to the possibility of altering its physical, chemical and submit it to enzymatic reactions. One of the enzymes related to the object of study of this work are ?-amylases, endocarbohydratases, which act by hydrolyzing ?-(1-4) bonds present in amylose and amylopectin, randomly in the central portion of the molecules. They have more affinity for substrates of higher molecular mass, creating a mixture of oligosaccharides of different sizes, which can be linear or branched, called dextrin or maltodextrin. Amylolytic enzymes are used on a large scale and one of these enzymes is CGTase, which have been gaining great prominence due to their ability to cyclize starch, thus generating cyclodextrins. The oligosaccharide cyclodextrin (CD) has 6 to 8 glucose residues linked by ?-(1-4) glycosidic bond and composing a ring-shaped macrocycle. There are 3 types of CDs, which are distinguished by the amount of glucose residues in the cycle: ?-cyclodextrins (6 glucose residues), ?-cyclodextrins (7 glucose residues) and ?-cyclodextrins (8 glucose residues). Three-dimensionally, cyclodextrins have a cone shape whose inner face has a nonpolar character and the outer face is polar. In this way, the CD molecule can encapsulate substances in its interior, causing profound physicochemical changes in them. The substance that forms an inclusion compound with CD may have increased stability, decreased volatility, thermal and oxidation resistance, decreased hydrolysis of labile compounds, increased solubility of insoluble compounds, among others. Therefore, DCs have great potential to be used industrially, with employment in the area of food, cosmetics, chemical technology, pharmaceuticals, pesticides, among many others. Due to the great commercial interest in the use of DCs, CGTases are widely studied and researchers in the area are constantly looking for new sources and ways to increase the yield of their production. These enzymes are produced by several species of free-living bacteria found in many different environments. Previously, through prospecting for CGTase-producing bacteria in Brazilian soil, the bacterium Bacillus firmus strain 37 was isolated and identified as a good producer of CGTase, which mainly produces ?-CD. In previous studies, the CGTase coding gene of this organism was sequenced, amplified and cloned for recombinant protein expression in a heterologous Bacillus subtilis system. However, to enable the commercial use of CGTase from B. firmus strain 37, an expression system that allows a higher enzymatic yield is necessary. For this reason, in the present work, the gene that encodes the CGTase of B. firmus strain 37 was cloned in a pET29a vector, which allows overexpression of the enzyme in the heterologous system of Escherichia coli. The planned plasmid was synthesized by a specialized company. Once the plasmid was purchased, it was replicated in the Top10 strain of E. coli and, for protein overexpression, transformed into the BL21(DE3) strain, also from E. coli. Cells were grown in liquid medium, and recombinant protein expression was induced by adding Isopropyl ?-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), a lactose analogue. Overexpression was confirmed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Cells containing the protein extract were lysed by sonication to release the overexpressed enzyme into the extracellular medium. The CGTase activity of this protein extract was evaluated by the phenolphthalein complexation method. The results showed that CGTase was expressed in the active form, having found an activity of 0,12 ?mol CD/mL. The present work was successful in obtaining an expression system for the CGTase enzyme from B. firmus strain 37 in E. coli in its active form. The protein produced in this way can later be purified to homogeneity and used for different industrial applications