Toxicological aspects of triclosan and chlorhexidine on the liver perfusion metabolism

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO: Os agentes antimicrobianos, triclosan (TCS) e clorexidina (CHX), pertencentes a classe dos bifenólicos policlorados e bi-biguanidas, respectivamente (estrutura química abaixo), são amplamente utilizados como antissépticos e conservantes em cosméticos e equipamentos médicos e apresentam diferentes mecanismos de ação dependendo da concentração. Estes fármacos vêm sendo identificados no meio ambiente, no solo e água, como também em alimentos, expondo continuamente seres vivos aos mesmos. Os efeitos do TCS e CHX em células de mamíferos são complexos, sendo que, um dos principais mecanismos de citotoxicidade envolve um comprometimento do metabolismo energético mitocondrial. Isto pois, ambos antimicrobianos dissipam o potencial de membrana e inibem o transporte de elétrons em mitocôndrias isoladas. Além disso, a CHX inibe a atividade da ATPase em altas concentrações (aproximadamente 100 ?M). Em suma, os efeitos tóxicos resultam de comprometimento da função mitocondrial, redução do potencial de membrana e dos níveis de ATP, além de aumento de Ca+2 intracelular e estresse oxidativo. Considerando que, nada se tem sobre a ação destes antimicrobianos em um órgão íntegro, onde a polaridade e microcirculação são preservadas, o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos dependentes da concentração, do TCS e da CHX, sobre o metabolismo de fígado de rato em perfusão, a fim de descrever os possíveis efeitos agudos dos fármacos sobre os fluxos metabólicos ligados ao metabolismo energético e fornecer informações adicionais sobre seus possíveis efeitos toxicológicos. MÉTODOS: Ratos Wistar machos (200-240 g) foram alimentados ad libitum com dieta padrão de laboratório. Os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de cetamina (70 mg/kg) mais xilazina (7 mg/kg). Após laparotomia, e canulação das veias porta e cava, o fígado foi posicionado em uma câmara de acrílico e perfundido no sistema não recirculante livre de hemoglobina. O líquido de perfusão, tampão Krebs/Henseleit-bicarbonato (pH 7,4), foi saturado com uma mistura de O2 e CO2 (95:5) por meio de um oxigenador de membrana e simultaneamente aquecido a 37 °C. Metabólitos no perfusado efluente foram analisados por meio de ensaios enzimáticos, e o consumo de oxigênio foi monitorado de forma contínua polarograficamente. O TCS foi solubilizado em DMSO e a CHX foi sonicada em água (5 minutos), antes da adição no líquido de perfusão. Nucleotídeos de adenina foram extraídos do tecido hepático e quantificados por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC; Shimadzu HPLC system, Japan). TCS foi quantificado no perfusado efluente por cromatografia líquida de alta eficiência (comprimentos de onda de detecção de 280 nm). As atividades das enzimas gliconeogênicas foram determinadas por meio de ensaios enzimáticos. Mitocôndrias de fígado foram isoladas por centrifugação diferencial e utilizadas para avaliar os efeitos dependentes de concentração da CHX sobre a respiração e a atividade das oxidases mitocondriais. A carboxilação do piruvato foi determinada em mitocôndrias intactas por meio da incorporação de 14C de [14C]Na+HCO3- em componentes do ciclo do ácido tricarboxílico e quantificada por cintilação líquida. A integridade celular e mitocondrial foi avaliada pela determinação da atividade da lactato desidrogenase e da fumarase no perfusado efluente por ensaios espectrofotométricos. RESULTADOS: Resumidamente os resultados mais importantes foram os seguintes: 1) O TCS e a CHX aumentaram a glicólise, o primeiro na concentração de 200 ?M e o segundo na faixa de 10 a 50 ?M. A razão NADH/NAD+ citosólica, indicada pela razão lactato/piruvato, também foi aumentada pelas drogas. 2) Os dois compostos inibiram de forma concentração dependente a gliconeogênese. Entretanto, a IC50 foi de aproximadamente 15 ?M para CHX e de 80 ?M para TCS para todos substratos avaliados. 3) O TCS estimulou a frutólise nas concentrações de 20 e 50 ?M, um efeito não mais presente na maior concentração. A CHX também estimulou a frutólise em sua menor concentração (10 ?M), mas esta via foi inibida a partir da concentração de 25 ?M. 4) A produção de lactato a partir de glicerol, foi estimulada pelo TCS. 5) TCS e CHX aumentaram a produção de amônia, mas somente a CHX inibiu a síntese de ureia a partir de alanina. 6) O consumo de oxigênio no fígado em perfusão, de forma geral, foi estimulado nas menores concentrações e inibido nas maiores concentrações. 7) Ambos compostos diminuíram os níveis de ATP celular e as razões ATP/ADP e ATP/AMP no fígado. 8) A metabolização hepática do TCS foi muito rápida, formando um gradiente de concentração pronunciado ao longo do leito sinusoidal. 9) A atividade das enzimas fosfoenolpiruvato carboxiquinase, glicose-6-fosfatase e frutose-1,6-bisfosfatase foram levemente modificadas pelo TCS. 10) A CHX desacoplou a fosforilação oxidativa e inibiu a cadeia transportadora de elétrons em mitocôndrias isoladas, com IC50 na faixa de 1 a 8 ?M dependendo do substrato utilizado. 11) A CHX também inibiu a carboxilação do piruvato e estimulou a liberação de lactato desidrogenase (enzima citosólica) e fumarase (mitocondrial) no perfusado efluente, sinalizando comprometimento da integridade celular. CONCLUSÕES: Pode-se concluir que o TCS e a CHX afetam o metabolismo energético do tecido hepático de forma complexa. Isto é indicado principalmente pela inibição das vias anabólicas (a gliconeogênese e ureagênese de forma específica pela CHX) e estimulação das vias catabólicas (glicólise e glicogenólise) em consequência da redução do conteúdo de ATP. Além disso, a alta metabolização do TCS pelas células hepáticas poderia justificar a maior intensidade dos efeitos biológicos pelas células periportais como também menor toxicidade biológica quando comparado à CHX. Em suma, exposições múltiplas e repetidas a estes antimicrobianos podem ser prejudiciais, especialmente ao tecido hepático, pois como observado os efeitos pode induzir ao organismo vivo um quadro de hipoglicemia, acidose láctica e hiperamonemia

ABSTRACT: INTRODUCTION: Antimicrobial agents, such as triclosan (TCS) and chlorhexidine (CHX), belonging to the class of polychlorinated biphenolics and bi-biguanides, respectively (chemical structure below), are widely used as antiseptics and preservatives in cosmetics and medical equipment and have different mechanisms of action depending on concentration. These drugs have been identified in the environment, soil and water, as well as in food, continuously exposing living beings to them. The effects of TCS and CHX on mammalian cells are complex, but one of the main mechanisms involved in cytotoxicity is their impairment of mitochondrial energy metabolism. Both TCS and CHX dissipate membrane potential and inhibit electron transport in isolated mitochondria. In addition, CHX inhibits ATPase activity at high concentrations (approximately 100 ?M). Therefore, toxic effects result from na impaired mitochondrial function, reduced mitochondrial membrane potential, and ATP levels, additionally to increased intracellular Ca+2 and oxidative stress. Considering that, nothing is known about the action of these antimicrobials in an intact organ, where polarity and microcirculation are preserved, the present study aimed to evaluate the concentration-dependent effects of TCS and CHX on rat liver metabolism in perfusion, in order to describe the possible acute effects of drugs on metabolic flows linked to energy metabolism and provide additional information on their possible toxicological effects. METHODS: Male Wistar rats (200-240 g) were fed ad libitum with standard laboratory diet. The animals were anesthetized with ketamine (70 mg/kg) plus xylazine (7 mg/kg) by intraperitoneal injection. After laparotomy, and portal and cava vena cannulation, the liver was put on an acrylic chamber and perfused in the free-hemoglobin non-recirculating system. The perfusion fluid, Krebs/Henseleit-bicarbonate buffer (pH 7.4), was saturated with a mixture of O2 and CO2 (95:5) by means of a membrane oxygenator and simultaneously heated to 37 °C. Metabolites were analyzed using standard enzymatic procedures in the perfused efluente, and the oxygen concentration was continously monitored polarographically. The TCS was solubilized in DMSO and the CHX was sonicated in water, before to addition to the perfusion fluid. Adenine nucleotides were extracted from liver tissue, and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC; Shimadzu HPLC system, Japan). TCS was quantified in the efluente perfused by HPLC (at detection wavelengths of 280 nm). The activities of gluconeogenese rate-controlling enzymes were determined by enzymatic assays. Liver mitochondria were isolated by differential centrifugation and used to assess the concentration-dependent effects of CHX on the respiration and mitochondrial oxidases. Pyruvate carboxylation was determined by 14C incorporation of [14C]Na+HCO3- into components of the tricarboxylic acid cycle in intact mitochondria. The cellular and mitochondrial integrity were assessed by lactate dehydrogenase and fumarase activity in efluente perfusate by spectrophotometric assays. RESULTS: Briefly, the most important results were the following: 1) TCS and CHX increased glycolysis, the former at a concentration of 200 ?M and the second in the range from 10 up to 50 ?M. The cytosolic NADH/NAD+ ratio, indicated by the lactate/pyruvate ratio, was also increased by the drugs. 2) Both compounds inhibited gluconeogenesis in dependence concentration way. However, IC50 was approximately 15 ?M for CHX and it one was 80 ?M for TCS for all performed substrates. 3) TCS stimulated fructolysis at 20 and 50 ?M concentrations, this effect no longer presents at the highest concentration. CHX also stimulated fructolysis in lowest concentration (10 ?M), but this pathway was inhibited from 25 ?M concentration. 4) Lactate production from glycerol was stimulated by TCS. 5) TCS and CHX increased the ammonia production, but only CHX inhibited urea synthesis from alanine. 6) Oxygen consumption, in general, was stimulated at lower concentrations and inhibited at higher concentrations by liver in perfusion. 7) Both compounds decreased cellular ATP levels, ATP/ADP and ATP/AMP ratios. 8) The hepatic metabolization of the TCS was very fast, leading to a pronounced concentration gradient along the sinusoidal plexus. 9) The activity of the phosphoenolpyruvate carboxykinase, glucose-6-phosphatase and fructose-1,6-bisphosphatase enzymes were slightly modified by TCS. 10) CHX uncoupled oxidative phosphorylation and inhibited the electron transport chain in isolated mitochondria, with IC50 ranging from 1 up 8 ?M depending on the substrate used. 11) CHX also inhibited pyruvate carboxylation and stimulated the release of cytosolic and mitochondrial enzymes in the perfused effluent, signaling impairment of cell structure. CONCLUSIONS: It can be concluded that, TCS and CHX affect energy metabolism in intact liver cells in a complex way. This is primarily indicated by inhibition of anabolic pathways (eg, gluconeogenesis and ureagenesis in a CHX-specific manner) and stimulation of catabolic pathways (glycolysis and glycogenolysis) in consequence of reduced ATP content. In addition, the high TCS metabolization by liver cells could justify the greater intensity of biological effects by periportal cells as well as less biological toxicity when compared to CHX. Therefore, multiple and repeated exposures can be harmful, especially to hepatic tissue, as long as observed the effects can lead to hypoglycemia, lactic acidosis, and hyperammonemia in a living being