Extratos de folha de oliveira (Olea europaea L.) obtidos por extração com líquidos pressurizados usando água/etanol : caracterização, otimização da extração, funções bioativas e adição em formulação de biscoito tipo cracker

Abstract

Resumo: Os compostos fenólicos são substâncias que apresentam um ou mais grupos fenóis na sua estrutura, atuando relevantemente como agentes antioxidantes, são amplamente investigados nas áreas de alimentos, medicina e farmácia, com destaque para os de origem natural. A este grupo de substâncias também é atribuído outras propriedades biológicas interessantes como ação antibacteriana, antiviral, modulação enzimática negativa e antimutagênica. As folhas de oliveira apresentam em sua composição conteúdo fenólico relevante, como secoiridóides, característicos da família Oleaceae. À classe dos secoiridóides são atribuídos efeitos biológicos significativos, tornando as folhas de oliveira uma fonte especial de obtenção destes bioativos. Neste trabalho, extração com líquido pressurizado usando água e etanol foi empregada para obter extratos com alto teor antioxidante de folhas de oliveira (Olea europaea L.). A influência da razão de solvente (100-50 % v/v água/etanol), temperatura (100-200 °C) e vazão de solvente (1-5 mL.min-1) no processo de extração foi investigada usando um planejamento experimental de Box-Behnken. ANOVA foi aplicada para determinar o ajuste das variáveis dependentes (rendimento de extração, capacidade antioxidante por DPPH, flavonoides totais, iridóides-glicosídeos totais e conteúdo fenólico total) em modelos de segunda ordem. Para a otimização, esses modelos foram utilizados para encontrar as condições ideais de extração por otimização Simplex sequencial combinada com a função de desejabilidade de Derringer e Suich, objetivando maximizar a capacidade antioxidante, recuperação total de iridóides-glicosídeos e conteúdo fenólico total. As condições ótimas da região para extração foram determinadas em uma razão de solvente de 53-65 % v/v água/etanol, a temperatura de extração de 100-120 °C e uma vazão de solvente de 3-4 mL.mL-1. Quinze compostos fenólicos foram identificados nas amostras usando HPLC-DAD-ESI/MSn, incluindo dois ácidos fenólicos (hidroxitirosol e hidroxitirosol glicosídeo), quatro flavonóis (apigenina-6,8-C-dihexosídeo, quercetina-3-O-rutinosídeo, luteolina-O-hexosídeo e derivados) e nove iridóides-glicosídeos (verbascosídeo, oleuropeína e derivados). A oleuropeína e seus derivados foram identificados como os principais compostos fenólicos no extrato na proporção de 89 % da composição do extrato. Dois extratos de folhas de oliveira, um aquoso e outro hidroalcoólico, foram testados quanto ao seu potencial neuroprotetor pelo estudo de inibição enzimática in vitro frente à acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BChE). Os resultados mostram que os extratos aquosos e hidroalcoólico inibiram significativamente a AChE (IC50 1,41 e 1,65 mg.mL-1 ) e BChE (IC50 2,71 e 1,28 mg.mL-1), respectivamente. O extrato hidroalcoólico foi adicionado em formulação de biscoito tipo cracker, e a cor, textura e composição centesimal foram comparadas em relação a uma formulação de biscoito controle. O biscoito com extrato apresentou cor (L*, a*, b*, C*, h° e ?E*) significativamente diferente do biscoito controle. Também, o biscoito tipo cracker com extrato manteve suas propriedades de cor e os parâmetros de dureza, fraturabilidade, mastigabilidade, elasticidade, gomosidade, coesividade e resiliência nos 30 dias de armazenamento. A adição de extrato de folha de oliveira na formulação do biscoito tipo cracker parece ter contribuído para a manutenção da dureza do mesmo ao longo do tempo estudado, em comparação ao biscoito controle.

Abstract: Phenolic compounds are substances that have one or more phenol groups in their structure, acting as antioxidant agents. These compounds, especially those of natural origin, are widely investigated in the areas of food, medicine, and pharmacy. Other interesting biological properties are attributed to this group of substances, such as antibacterial, antiviral, negative enzymatic modulation and antimutagenic. Olive leaves present relevant phenolic content in their composition, due to the presence of compounds classified as secoiridoids, characteristic of the Oleaceae family. Significant biological effects are already attributed to the secoiridoids class, making olive leaves a special source for obtaining these bioactives. In this research, pressurized liquid extraction with water and ethanol was employed to obtain high antioxidant extracts from olive leaves (Olea europaea L.). The influence of solvent ratio (100-50% v/v water/ethanol), temperature (100-200 °C), and solvent flow rate (1-5 mL.min-1) on the extraction process was investigated using a Box-Behnken experimental design. ANOVA was applied to determine the overall goodness of fit of the dependent variables (extraction yield, antioxidant capacity by DPPH, total flavonoids, total iridoid-glycoside, and total phenolic content) in second-order models. For the optimization, these models were used to find the optimal conditions using the Sequential Simplex optimization procedure combined with Derringer and Suich's desirability function to maximize 10 antioxidant capacity, total iridoid-glycoside recovery, and total phenolic content. The optimal region conditions for extraction were determined at a solvent ratio of 53-65 % v/v water/ethanol, the extraction temperature of 100-120 °C, and a 3-4 mL.min-1 solvent flow rate. Fifteen phenolic compounds were identified in the samples using HPLC-DAD-ESI/MSn, including two phenolic acids (hydroxytyrosol and hydroxytyrosol glucoside), four flavonols (apigenin-6,8-C-dihexoside, quercetin-3-O-rutinoside, luteolin-O-hexoside, and derivatives), and nine iridoid-glycosides (verbascoside, oleuropein, and derivatives). Oleuropein and derivates were identified as the major phenolic compounds in the extract obtained at optimal conditions as a percentage of 89 % of the extract composition. After the extraction and optimization step, two olive leaf extracts, one aqueous and one hydroalcoholic extract, were tested for their neuroprotective potential by the enzymatic inhibition in vitro study against acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE). Results show that the aqueous and hydroalcoholic extracts significantly inhibited AChE (IC50 1,41 e 1,65 mg.mL-1) and BChE (IC50 2,71 e 1,28 mg.mL-1), respectively. The hydroalcoholic extract was used to produce a functional snack cracker, and color, texture, and proximate composition were analyzed against a cracker control formulation. The functional cracker show color (L*, a*, b*, C*, h°, and ?E*) significantly different from the cracker control. Also, the cracker with extract maintained its color properties and parameters of hardness, fracturability, chewiness, elasticity, gumminess, cohesiveness and resilience during the 30 days of storage. The addition of olive leaf extract in the formulation of the snack cracker seems to have contributed to the maintenance of its hardness over the time studied, compared to the control cracker.