Alterações metabólicas causadas pela deficiência de andrógenos e estrógenos : I - revisão sistemática da esteatose hepática e da síndrome metabólica no hipogonadismo em homens e modelos animais. II - efeitos distintos da administração de melatonina em ratas normoestrogênicas e deficientes em estrógenos

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO – Embora a expectativa de vida humana tenha aumentado nos últimos séculos, ainda existem complicações de saúde na população idosa, muitas relacionadas ao declínio, dependente da idade, na produção dos hormônios gonadais. Nas mulheres, a falência ovariana cessa a produção de hormônios e resulta em redução rápida dos níveis séricos de estradiol (E2), a menstruação cessa, o que define a menopausa. Já nos homens, o principal andrógeno circulante é a testosterona (T). Ao contrário das mulheres, a função reprodutiva permanece comprometida nos homens mais velhos e nem todos eles têm deficiência de T. A T é mais alta na terceira década de vida, declinando com o avanço da idade em aproximadamente 0,4 a 1% ao ano. Na população idosa, a incidência de componentes da síndrome metabólica (SM) aumenta, tais como, ganho de peso corporal, diabetes tipo 2, resistência à insulina, doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e doenças cardiovasculares. A melatonina tem sido sugerida como uma alternativa à terapia de reposição estrogênica para os distúrbios associados à menopausa. No entanto, a capacidade da melatonina de prevenir ou tratar o ganho excessivo de peso corporal e distúrbios metabólicos relacionados ainda é controversa. OBJETIVOS -– Nesta revisão, investigamos a relação entre deficiência de testosterona, esteatose hepática e síndrome metabólica por uma revisão sistemática da literatura. O objetivo do nosso estudo foi analisar se o tratamento preventivo com melatonina é capaz de suprimir as alterações metabólicas induzidas pela deficiência de estrogênio em ratos OVX, com ênfase no ganho de peso e na adiposidade. Considere os efeitos da melatonina em animais normoestrogênicos para fornecer informações de segurança para uso em mulheres na pré-menopausa. MÉTODOS - No artigo I, foi realizada uma busca sistemática no banco de dados PubMed, incluindo as palavras relacionadas à deficiência de T, os distúrbios relacionados à SM e esteatose hepática. No artigo II, as ratas foram divididas em quatro grupos: ratas controle com operação simulada tratadas com solução salina (CON); ratas controles com operação simulada tratadas com melatonina (CON+MEL), ratas ovariectomizadas tratadas com salina (OVX) e ratas OVX tratadas com doses diárias de melatonina (OVX+MEL). No dia seguinte à cirurgia, uma dose de 10 mg/kg de melatonina foi administrada diariamente às ratas dos grupos CON+MEL e OVX+MEL por sonda esofágica por um período de 16 semanas. Nos dias dos experimentos, os animais foram sacrificados com tiopental sódico (50 mg/kg i.p) para coleta de amostras de sangue, fígado, tecido adiposo, útero e carcaça. Parâmetros biométricos e ingestão de alimentos foram medidos ao longo do período experimental. A carcaça foi utilizada para determinar sua composição; os tecidos adiposos foram utilizados para determinar o índice de adiposidade e para análise histológica. O colesterol total, a lipoproteína de alta densidade (HDL-colesterol), os triglicerídeos (TG) e a glicose foram analisados no soro/plasma por métodos padrão usando kits de ensaio. O conteúdo lipídico total do fígado foi determinado pelo método gravimétrico e o colesterol e triglicerídeos no fígado foram determinados por ensaios específicos em kits. As alterações histológicas no fígado também foram investigadas e a porcentagem de infiltração lipídica foi medida em cortes histológicos do fígado corados com Sudan III. Mitocôndrias do fígado foram isoladas por centrifugação diferencial para avaliação da respiração ligada à ?-oxidação de ácidos graxos, respiração acoplada à fosforilação de ADP, atividade de enzimas associadas às membranas e geração de H2O2. Parâmetros de estresse oxidativo celular foram avaliados em mitocôndrias e em homogenatos de fígado e tecido adiposo. Foram medidos os teores de glutationa reduzida (GSH), proteínas carboniladas e o conteúdo de malondialdeído (MDA) realizado pela técnica de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Foram determinadas as atividades das seguintes enzimas antioxidantes: superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa reductase (GSSG-red), glutationa peroxidase (GSH-Px) e glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD). O fígado intacto foi perfundido em outro lote de animais, no qual a oxidação dos ácidos graxos e a cetogênese foram medidos. RESULTADOS E DISCUSSÃO - No artigo de revisão, trinta e nove artigos foram incluídos e a maioria deles mostraram que baixos níveis de testosterona estão associados positivamente a distúrbios na homeostase da glicose, menor sensibilidade à insulina e dislipidemia. A distribuição de gordura e a composição corporal também são frequentemente modificadas sob condições de baixa testosterona. Alguns estudos verificaram a relação causal entre a DHGNA e os níveis séricos totais de T e indicaram que o fígado pode ser mais suscetível a engordar durante a deficiência de T. Quando os efeitos da terapia de reposição de T foram avaliados, os resultados mostraram que ela pode reverter alguns dos sinais clínicos da síndrome metabólica, o que enfatiza a importância da testosterona para a homeostase do metabolismo energético nos homens. No artigo original, os principais resultados foram os seguintes: A) O peso corporal de todas as ratas aumentou progressivamente durante as 16 semanas de tratamento. Após a terceira semana, o peso corporal das OVX foi maior que as CON (+26%). A administração de melatonina em ratas OVX+MEL não modificou o padrão de ganho de peso durante todo o período de tratamento, em comparação com OVX não tratadas, enquanto reduziu o ganho de peso em ratas CON+MEL, uma queda estatisticamente significativa após a sétima semana de tratamento. Nessas ratas o ganho de peso no final do tratamento foi 21% menor que nas CON e 55,5% menor em relação às OVX+MEL. O consumo alimentar não foi diferente. A composição da carcaça apresentou 5% menos matéria seca nas ratas OVX em comparação às ratas CON. Ratas OVX exibiram um aumento de 13% no extrato etéreo em relação aos valores das ratas CON e este extrato permaneceu elevado nas ratas OVX+MEL (+21% em relação às ratas CON). A melatonina induziu diminuição de 18% na porcentagem de extrato etéreo na carcaça de ratas CON+MEL. O índice de adiposidade foi 17% maior em ratas OVX em comparação às ratas CON que permaneceu elevado (+18%) nas ratas OVX+MEL. B) Os níveis médios de estradiol nas CON+MEL diminuíram 53% quando comparados às ratas CON. Não foram observadas diferenças significativas entre os quatro grupos de ratas nos níveis sanguíneos de FSH, glicose, triglicerídeos, colesterol total e suas lipoproteínas. Foi encontrada uma diferença significativa para os marcadores das funções hepáticas: as atividades da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotranferase (ALT) foram, respectivamente, 46% e 28% maiores no sangue de ratas OVX quando comparadas com ratas CON, e o tratamento com melatonina induziu uma reversão parcial nos níveis de ambas as enzimas. Apesar do aumento substancial no peso total de gordura inguinal nas ratas OVX, a análise histológica deste tecido revelou que o tamanho dos adipócitos era muito semelhante ao das ratas CON. Foi evidenciada prevalência de adipócitos com tamanho reduzido em ratas tratadas com melatonina, não apenas no OVX+MEL, mas também no CON+MEL. C) O conteúdo de GSH na gordura inguinal foi reduzido em 23% nas ratas OVX, efeito suprimido pela administração de melatonina (ratas OVX+MEL). Nas ratas CON+MEL, a melatonina induziu uma redução de 29% no teor de TBARS na gordura retroperitoneal, e na gordura inguinal, verificou-se uma diminuição de 41% no teor de GSH e um aumento no teor de tióis (+40%) quando comparado com os respectivos grupos não tratados. As atividades GSSG-red e G6PD foram 44% e 41% reduzidas, respectivamente, em OVX quando comparadas com os valores das ratas CON. A melatonina aumentou as atividades das duas enzimas antioxidantes GSSG-red e G6PD em ratas OVX+MEL para níveis equivalentes aos das ratas CON+MEL. Na gordura inguinal, a melatonina aumentou a atividade da CAT nas ratas OVX+MEL (+37% em relação às OVX). D) No fígado, o conteúdo de proteína carbonilada aumentou (+39%) e o conteúdo de GSH foi menor (-19%) nas ratas OVX quando comparado às CON. Nas ratas OVX+MEL, essas alterações foram suprimidas. As atividades da SOD e G6PD foram alteradas nas ratas OVX; já a administração de melatonina nas CON+MEL reduziu a atividade de G6PD para um valor médio 37% inferior ao das ratas CON. E) A quantificação de lipídios mostrou maior teor de gordura no fígado das ratas OVX. Triglicerídeos, mas não colesterol, foram os responsáveis pelo acúmulo de lipídios nas ratas OVX. O tratamento de ratas OVX+MEL reduziu os teores totais de lipídios e TG a valores semelhantes aos das ratas CON. Alterações significativas foram induzidas pelo tratamento com melatonina na respiração controlada por ácidos graxos em mitocôndrias desacopladas. Apesar das taxas semelhantes de respiração induzida por ácidos graxos nas mitocôndrias das ratas CON e OVX, com diversos substratos foi encontrado estímulo em ratas tratadas com melatonina, OVX+MEL e CON+MEL. Já no fígado intacto, a cetogênese foi aproximadamente 55% maior nas ratas CON+MEL do que nas ratas CON durante todo o período de infusão de palmitato. CONCLUSÃO PRINCIPAL – Na revisão, encontramos evidências da relação direta entre deficiência de T e síndrome metabólica. Programas de rastreamento em pacientes mais velhos ou com sobrepeso são importantes para ajudar a entender e detectar indivíduos com baixos níveis de T sérico para suplementar adequadamente. Deve-se considerar a importância de uma terapia específica para o tratamento da síndrome metabólica, que contemple todos os componentes da síndrome, o estágio da vida e o perfil hormonal como aspectos-chave para uma intervenção clínica assertiva. Finalmente, modificações no estilo de vida e na dieta parecem ser abordagens preventivas eficazes para evitar o acúmulo ectópico de gordura no fígado em homens com diagnóstico de deficiência de testosterona. Quanto ao artigo original, as ratas OVX, em nossa condição experimental, apresentaram características de adiposidade metabolicamente saudáveis, uma vez que as ratas não exibiram dislipidemia e sinais de resistência à insulina. A hipertrofia da gordura retroperitoneal e a hiperplasia da gordura inguinal na OVX provavelmente representam uma adaptação dos tecidos adiposos para armazenar maiores quantidades de lipídios e, assim, evitar a deposição ectópica de lipídeos. A administração a longo prazo de melatonina foi eficaz na prevenção do desenvolvimento de esteatose hepática e estresse oxidativo nas ratas OVX e, embora não tenha reduzido o ganho maior de adiposidade, a melatonina foi capaz de alterar a distribuição lipídica e a morfologia dos adipócitos em diferentes depósitos de gordura. A supressão da hipertrofia da gordura retroperitoneal e a preservação da hiperplasia da gordura inguinal sugeriram que a melatonina induziu uma redistribuição de lipídios em diferentes depósitos de gordura, reduzindo a sobrecarga lipídica excessiva e, assim, eliminando a possibilidade de células progredirem para inflamação e anormalidades relacionadas. Em ratas normoestrogênicas, a melatonina reduziu o ganho de peso corporal, reduziu o tamanho de adipócitos da gordura inguinal, reduziu a ingestão de alimentos e aumentou a oxidação hepática dos ácidos graxos. A melatonina também reduziu os níveis plasmáticos de estradiol em ratas controle. Pode-se concluir que a melatonina elimina o risco de desenvolver distúrbios metabólicos relacionados à deficiência de estrogênio, principalmente alterando a distribuição lipídica nos depósitos de gordura e suprimindo o estresse oxidativo dos tecidos. Sob condições normais de estrogênio, a melatonina pode induzir efeitos adversos, incluindo perda de peso corporal e distúrbios nas funções reguladas por estrogênio. Como a melatonina foi proposta como agente farmacológico no tratamento de muitas doenças, sua função em mulheres na pré-menopausa deve ser considerada com cuidado

ABSTRACT:INTRODUCTION – Even though human life expectancy has increased in recent centuries, there are still health complications in older population, many related to age- decline in gonadal hormones. In women, the production of sex steroid hormones by the ovaries stops, the serum estradiol (E2) level decreases rapidly, menstruation ceases, defining menopause. The main circulating androgen in men is testosterone (T). In contrast to women, reproductive function remains intact in older men and not all of them have T deficiency. T is highest in the third decade of life declining with advancing age by approximately 0.4 to 1% per year. In the elderly population, the incidence of metabolic syndrome (MetS) components increases, such as body weight gain, type 2 diabetes, insulin resistance, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and cardiovascular disease. Melatonin has been suggested as an alternative to estrogen replacement therapy for the menopause-associated disorders. However, the ability of melatonin to prevent or treat excessive body weight gain and related metabolic disorders is still controversial. AIMS – In this review, we investigate the relationship between testosterone deficiency, hepatic steatosis and metabolic syndrome by a systematic review of the literature. The objective of our study was to analyse whether preventive treatment with melatonin is able to suppress the metabolic changes induced by estrogen deficiency in OVX rats, with emphasis on weight gain and adiposity. Consider the effects of melatonin on normoestrogenic animals to provide safety information for use by premenopausal women. METHODS – In article I, a systematic search of the PubMed database was performed, including the words related to testosterone deficiency, the disturbs related to metabolic syndrome, metabolic syndrome and hepatic steatosis. In the article II the rats were divided into four groups: untreated control rats, SHAM-operated (CON); control rats treated with daily doses of melatonin (CON+MEL); untreated ovariectomized rats (OVX) and OVX rats treated with daily doses of melatonin (OVX+MEL). The day after surgery, a dose of 10 mg/kg of melatonin was daily administered to rats of the groups CON+MEL and OVX+MEL by esophageal gavage over a period of 16 weeks. On the days of the experiments, the animals were euthanized with thiopental sodium (50 mg/kg i.p) for collection of the blood samples, liver, adipose tissues, uterus and carcass. Biometrical parameters and food ingestion were measured along the experimental period. The carcass was used to determine its composition the adipose tissues were used to determine the adiposity index and for histological analysis. Total cholesterol, high-density lipoprotein (HDL-cholesterol), triglycerides (TG) and glucose were analysed in serum/plasma by standard methods using assay kits. The liver total lipid content was determined using the gravimetric method and cholesterol and triglycerides in the livers were determined by specific kit assays. Histological changes in the liver were also investigated and the percentage of lipid infiltration was measured in histological slices of the liver stained with Sudan III. Mitochondria were isolated from livers by differential centrifugation for evaluation of respiration linked to ?-fatty acid oxidation, respiration coupled to ADP phosphorylation, activity of enzymes associated to membranes and H2O2 generation. Parameters of cellular oxidative stress were evaluated in mitochondria and in liver and adipose tissue homogenates. The contents of reduced glutathione (GSH), carbonyl proteins and malondialdeyde (MDA) performed by the thiobarbituric acid reactive species (TBARS) technique were measured. The activities of the following antioxidant enzymes were determined: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione reductase (GSSG-red), glutathione peroxidase (GSH-Px) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The intact liver was perfused in another batch of animals, in which the fatty acids oxidation and ketogenesis was measured. RESULTS AND DISCUSSION In the review article, thirty-nine articles were included and most of them show that low testosterone levels are positively associated with disturbs on glucose homeostasis, lower insulin sensitivity and dyslipidaemia. The fat distribution and body composition are also frequently modified under low testosterone condition. Some studies verify the causal relationship between NAFLD and total serum T levels and have indicated that the liver may be more susceptible to becoming fatty during T deficiency. When the effects of T replacement therapy were evaluated, the results showed that it can reverse some of the clinical signs of metabolic syndrome, which emphasizesthe importance of the testosterone for the homeostasis of the energy metabolism in men. Screening programs in older or overweight patients are necessary to understand and detect individuals with low serum T and supplement accordingly. The importance of a specific therapy to treat MetS should be considered, which contemplate every component of the syndrome, the stage of life and the hormonal profile as key aspects for an assertive clinical intervention. Finally, lifestyle and diet modifications can be adopted as preventive approaches to avoid the ectopic accumulation of fat in the liver in men with diagnose of testosterone deficiency. In the original article, the main results were the following: A) The body weight (BW) of rats increased progressively during the 16 weeks of treatment. After the 3rd week the body weight of OVX rats was higher than the CON rats (+26%). Melatonin administration to OVX+MEL rats did not modify the pattern of body weight gain during all periods of treatment when compared with that one of untreated- OVX rats and reduced the body weight gain of CON+MEL rats which was significant after the 7th week of the treatment. The effective body weight gain at the terminus of treatment was 21 % lower than the CON rats and 55.5 % relative to OVX+MEL. The food consumption was not different among them. The composition of the carcass had 5% lower dry matter in OVX rats compared with the CON rats. OVX rats exhibited a 13% increase in ethereal extract relative to values of CON rats and this extract remained elevated in OVX+MEL rats (+21% relative to CON rats). Melatonin induced a decrease of 18 % in the percentage of ethereal extract in CON+MEL rats. The adiposity index was 17% higher OVX rats compared to CON rats that remained elevated (+18%) in OVX+MEL rats. B) The mean levels of estradiol in CON+MEL reduced by 53% when compared to CON rats. No significant differences were observed among the four groups of rats in the blood levels of FSH, glucose, triglycerides, total cholesterol and its lipoproteins. A significant difference was found for markers of hepatic functions: the activities of AST and ALT were, respectively, 46% and 28% higher in the blood of OVX rats when compared with CON rats, and melatonin treatment induced a partial reversion in the levels of both enzymes. Despite substantial increase in the total weight of inguinal fat in OVX rats, histological analysis of this tissue revealed that the size of adipocytes was very similar to that of the CON rats. In the retroperitoneal tissue the analysis of the distribution of adipocyte according to their areas revealed hypertrophy of adipocytes in OVX rats, which melatonin was able to prevent. C) The content of GSH in inguinal fat that was 23% reduced in OVX rats, an effect that was suppressed by melatonin administration (OVX+MEL rats). In CON+MEL rats melatonin induced a 29% reduction in the TBARS content in retroperitoneal fat and in inguinal fat it was found a decrease of 41% in the GSH content and an increased protein thiols content (+40%) when compared with their respective untreated groups. The GSSG-red and G6PD activities were 44% and 41% reduced, respectively, in OVX when compared with the values of the CON rats. Melatonin increased the activities of the two antioxidant enzymes GSSG-red and G6PD in OVX+MEL rats to equivalent levels of those of CON rats. In inguinal fat, melatonin increased the CAT activity in OVX+MEL (+37% than OVX). D) In the liver, the protein carbonyl groups content increased (+39%) and the GSH content was lower (-19%) in OVX rats when compared to CON. In OVX+MEL rats these alterations were suppressed. The activity of SOD and G6PD were altered in OVX and the administration of melatonin in CON+MEL rats reduced the activity of G6PD to a mean value 37% above of that of CON rats. E) The quantification of lipids showed high content of fat in livers from OVX rats. Triglycerides and not total cholesterol accounted to lipid accumulation in OVX rats. The treatment of OVX rats with melatonin reduced both total lipid and TG contents to values very similar to those of CON rats. Significant changes were induced by melatonin treatment in the FA-driven respiration in uncoupled mitochondria. Despite the similar rates of FA-induced respiration in mitochondria from the CON and OVX rats, irrespective of fatty acid oxidized, a stimulus was found in melatonin-treated rats in both ovariectomized OVX+MEL and CON+MEL rats. In the intact liver the ketogenesis in was approximately 55% higher in CON+MEL rats than in CON rats in the whole period of palmitate infusion. MAIN CONCLUSION - In the review, we found evidences of the direct relationship between T deficiency and metabolic syndrome. Screening programs in older or overweight patients are important to help the understanding and detection of individuals with low serum T levels to supplement adequately. It should be considered the importance of a specific therapy for the treatment of metabolic syndrome, which contemplates all the components of the syndrome, the stage of life and the hormonal profile as key aspects for an assertive clinical intervention. Finally, changes in lifestyle and diet seem to be effective preventive approaches to avoid the ectopic accumulation of fat in the liver in men with a diagnosis of testosterone deficiency. Regarding the original article, OVX rats, under our experimental condition, exhibit features of metabolically healthy adiposity, since the rats did not exhibit dyslipidemia and signs of insulin resistance. Retroperitoneal fat hypertrophy and inguinal fat hyperplasia in OVX probably represent an adaptation of adipose tissues to store larger amounts of lipids and, thus, to avoid ectopic lipid deposition. Long-term administration of melatonin was effective in preventing the development of hepatic steatosis and oxidative stress in OVX rats, and although it did not reduce increased adiposity, melatonin was able to alter lipid distribution and adipocytes morphology in different fat depots. The suppression of retroperitoneal fat hypertrophy and preservation of inguinal fat hyperplasia suggested that melatonin induced a redistribution of lipid in different fat depots, reducing excessive lipid overload and, thus, eliminating the possibility of cells progressing to inflammation and related abnormalities. In normoestrogenic rats, melatonin reduced body weight gain, reduced inguinal fat adipocyte size, reduced food intake, and increased fatty acid hepatic oxidation. Melatonin also reduced plasma estradiol levels in control rats. It can be concluded that melatonin eliminates the risk to develop estrogen deficiency-related metabolic disorders, mainly by altering the lipid distribution in fat depots and suppressing tissues oxidative stress. Under normal estrogen condition, melatonin may induce adverse effects, including body weight loss and disturbance in estrogen-regulated functions. Because melatonin has been proposed as a pharmacological agent in the treatment of many diseases, its function in premenopausal women should be regarded with care