O fotossensibilizador hipericina, nanoencapsulado em P123, altera o metabolismo hepático da glicose em camundongos Swiss alimentados

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO – A terapia fotodinâmica (TFD) é utilizada para o tratamento de diversas patologias que apresentam como característica o crescimento anormal de tecidos, como tumores. Consiste na administração tópica ou sistêmica de um agente fotossensibilizador, seguido de sua excitação com luz, para a formação de espécies reativas de oxigênio, as quais promovem a morte celular. A vantagem da TFD está na sua alta seletividade (maior concentração do fotossensibilizador em células alteradas e a localização da iluminação). A hipericina tem se mostrado uma promissora molécula para ser utilizada como fotossensibilizador na TFD e no fotodiagnóstico. O mecanismo de ação fotossensível da hipericina envolve o estímulo na produção de espécies reativas de oxigênio para suprimir o tecido tumoral por estresse oxidativo. Embora o seu acúmulo ocorra principalmente nas células doentes, as células saudáveis também podem captar a hipericina. Desta forma, mesmo que em menor grau, o tecido saudável também pode ter seus parâmetros metabólicos alterados. O conhecimento dos efeitos da hipericina sobre o metabolismo das células de mamíferos é bastante restrito, especialmente o metabolismo das células hepáticas. Desta forma, esse trabalho avaliou o efeito da hipericina nanoencapsulada, na presença e ausência de ativação luminosa, sobre o metabolismo hepático da glicose em camundongos Swiss em perfusão in situ. OBJETIVOS - Avaliar o efeito do fotossensibilizador hipericina sobre o metabolismo hepático da glicose em camundongos Swiss alimentados. MÉTODOS – A incorporação da hipericina no sistema micelar seguiu a proporção fármaco-micela de 6:1, e o preparo do formulado foi executado conforme o método de dispersão sólida. Os camundongos machos adultos da linhagem Swiss tiveram sua glicemia pós-prandial medida. Com o objetivo de avaliar o metabolismo da glicose, principalmente a liberação hepática de glicose, todos os experimentos foram realizados com animais alimentados. Foram utilizados 40 animais, distribuídos em diferentes grupos: animais controle, estimulados somente com o copolímero, na concentração de 350 ?g/mL (P123 350), animais controle, estimulados somente com o copolímero, na concentração de 750 ?g/mL (P123 750), animais estimulados, com o formulado contendo hipericina nanoencapsulada no copolímero, na concentração de 350 (copolímero) ?g/mL + 0,7 (hipericina) ?g/mL, na ausência de estímulo luminoso (P123 + Hip 350/0,7-ni), animais estimulados, com o formulado contendo hipericina nanoencapsulada no copolímero, na concentração de 750 (copolímero) ?g/mL + 1,5 (hipericina) ?g/mL, na ausência de estímulo luminoso (P123 + Hip 750/1,5-ni) e animais estimulados, com o formulado contendo hipericina nanoencapsulada no copolímero, na concentração de 750 (copolímero) ?g/mL + 1,5 (hipericina) ?g/mL, na presença de estímulo luminoso (P123 + Hip 750/1,5-i). A avaliação do metabolismo hepático em cada um dos grupos foi realizada pela técnica de perfusão de fígado in situ, mensurando-se a liberação hepática de glicose (LHG), glicogenólise (GG), glicólise (GC) e razão NADH/NAD+. Também foi avaliada a lesão hepática através da determinação da concentração de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), bilirrubinas totais (BT) e fosfatase alcalina (ALP). Ainda foi possível calcular a captação hepática de hipericina através das análises espectrofotométricas por absorção eletrônica e intensidade de emissão de fluorescência. RESULTADOS – A respeito das enzimas ALT e AST, foi verificado que o nível de toxicidade do P123 (ambas as concentrações) é reduzido pela adição da hipericina (ambas as concentrações) e mais reduzido ainda pela iluminação da mesma. Com relação à ALP e BT, o P123 não alterou ou mesmo reduziu esses parâmetros na maioria dos grupos, com exceção do grupo P123 + Hip 350/0,7-ni, onde foi observado aumento da BT. O P123 associado ou não à hipericina, e a hipericina na ausência e presença da iluminação, reduziram a razão NADH/NAD+. Após a retirada dos compostos, ou seja, no período de basal posterior (B2) a razão não foi restabelecida nos grupos, com exceção do grupo iluminado, que restabeleceu 50% do potencial redutor. Adicionalmente, houve redução da GC em todos os grupos no período estimulado (EST) e B2, com exceção do grupo iluminado, que teve a mesma restaurada no B2. No período basal anterior (B1), houve elevada GG, LHG, e GC. Todos os compostos utilizados reduziram a taxa de GG do período EST e B2, com exceção do grupo iluminado, que manteve a taxa equivalente ao B1, para o período EST, e 50% no B2. A LHG foi reduzida pelos compostos (EST) e mais severamente pela remoção dos mesmos (B2), com exceção novamente do grupo Hipericina iluminada. Neste, houve menor redução da LHG comparado aos demais grupos (para EST). No entanto, diferentemente da GG, o grupo iluminado apresentou drástica queda da LHG após a retirada do composto. DISCUSSÃO – A análise dos parâmetros de lesão hepática do perfusado indicou que o copolímero (P123) per se aumenta ALT e AST. A adição da hipericina ao P123, na ausência de iluminação, diminuiu a liberação de ALT induzida pelo P123 e não alterou a AST já aumentada pelo P123, ou seja, não apresentou efeito sobre AST. A iluminação da hipericina não alterou ALT e AST, dessa forma, a iluminação diminuiu muito o efeito hepatotóxico do copolímero sobre ALT e AST. A hipericina iluminada mostrou eficiente potencial oxidativo no fígado, sem alterar a viabilidade energética do órgão, já que o quadro foi revertido após sua remoção, provavelmente pela reativação da glicólise. O motivo da não reativação da glicólise e elevação da razão NADH/NAD+ nos outros grupos necessita maiores investigações. O fato de o grupo iluminado ter mantido a GG elevada, indica um efeito mais próximo do fisiológico. A queda drástica da LHG em B2 observada no grupo iluminado implica que a glicose foi direcionada para a GC, o que pode ser um mecanismo compensatório desencadeado após a retirada do composto e devido a este ter inibido esta via durante sua passagem pelo fígado. No entanto, a GC foi inibida por todos os outros compostos no período EST e nenhum deles mostrou efeito equivalente ao do grupo iluminado. CONCLUSÃO – Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram em fígado de camundongos Swiss, que a hipericina (1,5 ?g/mL) nanoencapsulada no copolímero P123 (750 ?g/mL) e iluminada por uma placa de luz branco quente, com emissão no visível, apresentou efeitos diversos sobre o metabolismo hepático, a saber: (i) não alterou os parâmetros de lesão hepática ALT, AST, ALP e BT; (ii) não alterou a GG; (iii) reduziu a LHG; (iv) apresentou elevado potencial oxidativo; (v) inibiu a GC e (vi); reduziu a razão NADH/NAD+ citosólica. Apesar de necessitar de maiores investigações, principalmente sobre os efeitos no sistema antioxidante celular, a hipericina nanoencapsulada parece ter possibilidade promissora de aplicação dos efeitos biológicos sobre o fígado não saudável, a exemplo do que já vem sendo feito com sucesso em doenças que promovem lesões de pele, intestino e ureteres

ABSTRACT: INTRODUCTION - Photodynamic therapy (PDT) is used for the treatment of several pathologies that present abnormal tissue growth, such as tumors. It consists of the topical or systemic administration of a photosensitizing agent, followed by its excitation with light for the formation of reactive oxygen species, which promote cell death. The advantage of PDT is its high selectivity (greater concentration of photosensitizer in altered cells and location of illumination). Hypericin has been shown to be a promising molecule to be used as a photosensitizer in PDT and in photodiagnosis. The mechanism of photosensitive action of hypericin involves the stimulation in the production of reactive oxygen species to suppress the tumor tissue by oxidative stress. Although its accumulation occurs mainly in diseased cells, healthy cells can also pick up hypericin. In this way, even to a lesser extent, healthy tissue may also have its metabolic parameters altered. The knowledge of the effects of hypericin on the metabolism of mammalian cells is quite restricted, especially the metabolism of liver cells. Thus, this work evaluated the effect of nanoencapsulated hypericin, in the presence and absence of light activation, on hepatic glucose metabolism in Swiss mice in in situ perfusion. AIMS - Evaluate the effect of the hypericin photosensitizer on the hepatic glucose metabolism in feed Swiss mice. METHODS - The incorporation of hypericin into the micellar system followed the drug-micelle ratio of 6:1, and the preparation of the formulation was performed according to the solid dispersion method. Adult males from the Swiss strain had their postprandial blood glucose measured. In order to evaluate the metabolism of glucose, mainly the hepatic glucose release, all experiments were performed with fed animals. A total of 40 animals were used, distributed in different groups: control animals, stimulated only with the copolymer, at a concentration of 350 ?g/mL (P123 350), control animals, stimulated only with the copolymer, at a concentration of 750 ?g/mL (P123 750), stimulated animals, with the formulation containing nano-encapsulated hypericin in the copolymer, at the concentration of 350 (copolymer) ?g/mL + 0,7 (hypericin) ?g/mL, in the absence of light stimulus (P123 + Hip 350/0.7-ni), stimulated animals, with the formulation containing nano-encapsulated hypericin in the copolymer, at the concentration of 750 (copolymer) ?g/mL + 1,5 (hypericin) ?g/mL, in the absence of light stimulus (P123 + Hip 750/1,5-ni) and stimulated animals, with the formulation containing nano-encapsulated hypericin in the copolymer at the concentration of 750 (copolymer) ?g/mL + 1,5 (hypericin) ?g/mL, in the presence of light stimulus (P123 + Hip 750/1,5-i). The liver metabolism in each group was evaluated by in situ liver perfusion, measuring hepatic glucose release (HGR), glycogenolysis (GG), glycolysis (GC) and NADH/NAD+ ratio. Hepatic injury was also evaluated by determining the concentration of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), total bilirubin (BT) and alkaline phosphatase (ALP). It was still possible to calculate the hepatic uptake of hypericin through the spectrophotometric analyzes by electronic absorption and fluorescence emission intensity. RESULTS - Concerning the ALT and AST enzymes, it was verified that the toxicity level of P123 (both concentrations) is reduced by the addition of hypericin (both concentrations) and further reduced by the illumination thereof. Regarding ALP and BT, P123 did not alter or even reduce these parameters, in most groups, except for P123 + Hip 350-ni, where an increase in BT was observed. P123 associated or not to hypericin and hypericin in the absence and presence of enlightenment reduced the NADH/NAD+. After the withdrawal of the compounds, that is, in the posterior basal period (B2), the ratio was not reestablished in the groups, with the exception of the illuminated group, which reestablished 50% reduction potential. In addition, there was a reduction of GC in all groups in the stimulated (EST) and B2 periods, with the exception of the illuminated group, which had the same, restored in B2. In the anterior basal period (B1), there was elevated GG, HGR, and GC. All the compounds used reduced the GG rate of the EST and B2 periods, with the exception of the illuminated group, which maintained the rate equivalent to B1 for the EST period and 50% in B2. HGR was reduced by compounds (EST) and more severely by removal of them (B2), except again from the illuminated Hipericin group. In this, there was a lower HGR reduction compared to the other groups (for EST). However, unlike GG, the illuminated group showed a drastic drop in HGR after removal of the compound. DISCUSSION - Analysis of the hepatic injury parameters of the perfused indicated that the copolymer (P123) per se increases ALT and AST. The addition of hypericin to P123, in the absence of illumination, decreased the release of ALT induced by P123 and did not alter the AST already increased by P123, that is, it had no effect on AST. The hypericin illumination did not alter ALT and AST, so illumination has greatly decreased the hepatotoxic effect of the copolymer on ALT and AST. Iluminated hypericin showed an efficient oxidative potential in the liver, without altering the energetic viability of the organ, since the condition was reversed after its removal, probably due to reactivation of glycolysis. The reason for non-reactivation of glycolysis and elevation of the NADH/NAD+ ratio in the other groups requires further investigation. The fact that the illuminated group maintained GG elevated indicates an effect closer to the physiological. The drastic fall of HGR into B2 observed in the illuminated group implies that the glucose was directed to the GC, which can be a compensatory mechanism triggered after the withdrawal of the compound and because this has inhibited this route during its passage through the liver. However, GC was inhibited by all other compounds in the EST period and none of them showed equivalent effect to that of the illuminated group. CONCLUSION - The results obtained in this work demonstrated, in liver of Swiss mice, that hypericin (1.5 ?/mL) nanoencapsulated in the P123 copolymer (750 ?g/mL) and illuminated by a plate of warm white light with emission in the visible, presented diverse effects on the hepatic metabolism, namely: (i) did not alter ALT, AST, ALP and BT, liver injury parameters; (ii) did not alter GG; (iii) reduced HGR; (iv) showed high oxidative potential; (v) inhibited GC and (vi); reduced the NADH/NAD+ cytosolic ratio. Despite the need for further research, especially on the effects on the cellular anti-oxidant system, nanoencapsulated hypericin seems to have a promising possibility of applying the biological effects on the unhealthy liver, as has already been successfully done in diseases that promote lesions of the skin, intestine and ureters