A autorregulação e a neuromodulação do terminal nervoso motor são dependentes do transporte de colina para o terminal e da liberação de adenosina a partir das células de Schwann

Abstract

RESUMO: Introdução: A acetilcolina (ACh) é o neurotransmissor liberado dos terminais nervosos colinérgicos. Após ser liberada para a fenda sináptica, a ACh pode interagir com receptores presentes no terminal nervoso motor (TNM), na musculatura esquelética, ou ainda, ser hidrolisada a acetato e colina pela ação da enzima acetilcolinesterase. Interagindo com os receptores nicotínicos da placa motora, a ACh determina a abertura de um canal central em cada receptor levando, como consequência, ao aumento do influxo de íons sódio e a saída de íons potássio. Esse aumento de condutância iônica pode atingir um nível limiar crítico, o qual determinará a ocorrência do potencial de placa terminal (PPT) que, por sua vez, induzirá a contração da musculatura esquelética. Interagindo com os receptores do TNM a ACh pode aumentar ou reduzir sua própria liberação, ativando receptores nicotínicos neuronais (Nn) que expressam as subunidades ?3?2 (facilitatórios), muscarínicos do subtipo M1(facilitatórios) e muscarínicos do subtipo M2 (inibitórios). A transmissão neuromuscular também é modulada por receptores de adenosina presentes no TNM. Tais receptores podem aumentar (A2A) ou reduzir (A1) a liberação de ACh, dependendo da demanda à qual o nervo está submetido. A adenosina que ativa tais receptores é proveniente da coliberação da ACh com ATP. Este último é degradado à adenosina por uma sequência de reações catalisadas por ectonucleotidases presentes na fenda sináptica. A adenosina também pode ser transportada do interior do TNM, por meio dos transportadores NBT1, para a fenda sináptica. As ativações dos receptores M1 e A1 são preferenciais quando baixas frequências (~5,0 Hz) de estimulações estão sendo aplicadas sobre o nervo motor, já que, em tais condições, há a presença de pequenas quantidades de adenosina na fenda sináptica. Por outro lado, há uma predominância da atividade dos receptores M2 e A2A quando o TNM passa a receber frequências de estimulação mais elevadas (? 50,0 Hz), uma vez que, em tais condições, o nível de adenosina na fenda sináptica está aumentado. Conversas cruzadas (cross-talking) entre os receptores facilitatórios M1 e A2A e inibitórios M2 e A1 ocorrem no TNM. Demonstrou-se que a ativação de M1 reduz a atividade inibitória de M2. Os receptores M2 podem ter sua atividade reduzida pela ativação dos receptores A1 via down-regulation. Por outro lado, a atividade de M1, por sua vez, é reduzida quando os receptores A2A estão plenamente ativados (frequência de estímulos ?50 Hz), podendo assim, levar a uma intensificação da atividade inibitória dos receptores M2 do TNM. Concomitantemente a estas interações acima descritas, também está ocorrendo o transporte de moléculas de colina para o interior do TNM, para que tal substrato possa participar na síntese de novas moléculas de ACh. Na membrana pré-sináptica existem dois tipos de transportadores de colina. Os transportadores de alta afinidade (sódio dependente, inibidos seletivamente pelo hemicholinium-3) e de baixa afinidade (sódio independente). Os transportadores de colina são tão importantes para o controle da transmissão neuromuscular, que qualquer ineficiência em suas atividades determina grave redução na quantidade de moléculas de ACh liberada dos TNM, à qual, por sua vez, pode culminar no aparecimento de síndromes miastênicas. Sendo assim, modelos de fadiga tetânica com a utilização do hemicholinium-3 (HC-3) podem ser úteis para investigar as adaptações neuroquímicas pré-sinápticas que ocorrem nessas síndromes. Com base no exposto, o primeiro artigo desta tese teve como objetivo investigar se as ativações dos receptores M1 e A2A poderiam atenuar a fadiga tetânica induzida por HC-3 em preparações neuromusculares. Adicionalmente, tem sido verificado que moléculas de colina, por si mesmas, poderiam interagir com receptores nicotínicos do subtipo ?7(RCNn-?7). Desde que a presença de receptores RCNn-?7 foi demonstrada em células de Schwann (CS) presentes nos axônios motores, levantamos a hipótese de que a colina poderia ter um papel modulador da transmissão neuromuscular, além da sua bem demonstrada participação na etapa de síntese das moléculas de ACh do TNM. Esta hipótese poderia ter um impacto relevante sobre o uso de agentes anticolinesterásicos na prática clínica, uma vez que tais fármacos, como a neostigmina, são comumente utilizados para melhorar a transmissão neuromuscular em pacientes miastênicos, ou para reverter o bloqueio da transmissão neuromuscular em pacientes tratados com relaxantes musculares não despolarizantes. Além disso, não há registros da natureza química do mediador que seria liberado das CS após a ativação dos receptores RCNn-?7 presentes em tais células. Desta forma, no segundo artigo apresentado nesta tese, foi investigado se a adenosina poderia ser o gliotransmissor que faria a mediação da inibição da liberação de ACh após ativação de RCNn- ?7 em CS e como tal via neuroquímica poderia estar ligada aos efeitos clínicos de agentes anticolinesterásicos. Metodologia: O comitê de ética de experimentação animal da Universidade Estadual de Maringá aprovou (nº 7227300915/ CEUA-UEM) todos os procedimentos utilizados nesta tese. Os experimentos realizados no Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS)/ Universidade do Porto seguiram as recomendações da Convenção para a Proteção dos Animais Vertebrados Utilizados para Experimentação e outros fins científicos. Preparações nervo frênico-diafragma isolado de ratos Wistar foram utilizadas para medir (i) contrações do músculo esquelético durante alta frequência de estimulação (50 Hz), (ii) liberação de ACh marcada com trício e, (iii) quantificação da exocitose do neurotransmissor por video-microscopia em tempo real usando, como marcador fluorescente, o FM4-64. Para o registro e análise do perfil das contrações musculares (i), as preparações foram indiretamente estimuladas com pulsos de 0,2 Hz e, a cada 20 minutos, estímulos tetanizantes (50 Hz) foram aplicados no nervo frênico, durante 10 segundos. No primeiro artigo, o perfil das contrações encontrado após a estimulação foi analisado por meio da razão (R) entre a tensão tetânica obtida no final (B) da estimulação e tensão tetânica produzida no início (A) (R=B/A). Os valores de R obtidos após a administração das drogas foram considerados como porcentagem do valor de R controle (sem drogas). O HC-3 foi administrado 35 min após o tétano controle e os valores da razão B/A obtidos 45 min após a adição do HC-3 foram comparados. Quando fizemos associações de fármacos, tais agentes foram administrados 20 min antes da adição do HC-3. Para comparação, o efeito inibitório da neostigmina também foi testado 40 min depois do bloqueio seletivo do receptor nicotínico ?3?2. No segundo artigo, colina e PNU 282987foram introduzidos no mesmo instante do HC-3. Ainda no segundo artigo, um cateter de polietileno foi introduzido na veia cava inferior para injeção retrógrada de 0,5 ?M de ACh a fim de verificar os efeitos pós-sinápticos de drogas. A quantificação direta da ACh (ii) foi avaliada somente no segundo artigo. O protocolo experimental baseou-se em quatro períodos, sendo eles, equilíbrio (30 min), marcação (cloreto de colina marcada com trício - 1 Hz - 40 min), lavagem (HC-3 - 60 min) e liberação (S1 e S2). Os fármacos foram adicionados 15 minutos antes do S2 e estavam presentes até o final do período de liberação. Os efeitos dos mesmos foram avaliados pela comparação das razões S2/S1: S2 na presença de fármacos e S1 na ausência de fármacos. Os parâmetros de estimulação (5 e 50 Hz) nos períodos S1 e S2 foram monitorizados em um osciloscópio e foram aplicados uma série de 5 tétanos, cada um com 150 pulsos, separados por um intervalo de 20 segundos sem estimulação. Sendo assim, a liberação do neurotransmissor foi determinada pela quantificação do efluxo evocado de trício, a partir das terminações marcadas com colina. A técnica de vídeo-microscopia em tempo real (iii) teve como objetivo medir a exocitose de ACh em tempo real. A preparação passou por 4 etapas. Após o período de equilíbrio, ocorreu incubação da preparação com alfa-bungarotoxina, durante 20 min, para evitar contrações das fibras musculares, o que dificultaria a análise dos sinais de fluorescência. Em algumas preparações, a paralisia do diafragma foi realizada com ?-conotoxina, uma toxina que bloqueia os canais de sódio dependentes de voltagem do músculo esquelético, mas não os do nervo. A preparação passou por uma lavagem e recebeu o corante fluorescente FM4-64, durante 10 min. Após esse período de incubação com o corante, o nervo foi estimulado com 250 pulsos de intensidade supramáxima (duração de 0,04 ms, 8 mA) aplicados na frequência de 50 Hz. Após um período de 10 minutos de repouso da preparação, já na presença do corante, a fluorescência do FM4-64 foi lavada vigorosamente durante 30 minutos. Após a lavagem do corante, a taxa de exocitose vesicular foi medida a partir do decaimento resultante no sinal de fluorescência (hotspots) obtida após a estimulação. Resultados e discussão: Nos experimentos para registros miográficos do primeiro artigo, a ativação dos receptores A2A e M1 com CGS21680 e McN-A-343c respectivamente, aumentou os valores de R. Efeitos facilitatórios similares foram obtidos com a ativação da proteína kinase C (PKC) e A (PKA) com forskolin (FSK) e forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), respectivamente. Por outro lado, a administração de HC-3 causou uma redução nos valores da razão B/A, diminuiu a exocitose medida por vídeo microscopia e impediu a facilitação do aumento da razão B/A causada por CGS21680, McN- A-343c e FSK, com um efeito menor sobre o PMA. A neostigmina também diminuiu a exocitose de ACh, cujo efeito foi impedido por HC-3. Estes resultados indicam que a facilitação tetânica da transmissão neuromuscular causada pela ativação de receptores A2A e M1 é dependente da captação de colina pelo transportador de colina de alta afinidade, e que a fadiga tetânica da neostigmina pode ser atenuada pelo bloqueio do transportador de colina. No segundo artigo, nos experimentos de miografia e de quantificação direta de ACh marcada, a colina e o agonista seletivo dos RCNn-?7, PNU282987, diminuíram a capacidade da transmissão neuromuscular em manter uma adequada e sustentada contração muscular. Um efeito inibitório similar foi encontrado na técnica de vídeo microscopia. Por outro lado, o antagonista RCNn-?7 metilcaconitina (MLA) e o fluoroacetato foram capazes de prevenir os efeitos inibitórios do PNU282987, bem como da neostigmina na exocitose em tempo real. Esses resultados sugerem que as CS participariam ativamente da redução da liberação de ACh do TNM, naquelas situações em que as moléculas de ACh na fenda sináptica atingissem concentrações suficientes para ativar os RCNn-?7. Nestas condições, tais receptores estariam envolvidos no controle negativo da liberação de ACh. A remoção de adenosina endógena com adenosina desaminase (ADA), a inibição da liberação de adenosina pelo transportador ENT1 com S-(4-nitrobenzil)-6-tioinosina (NBTI) e o bloqueio dos receptores A1 com 1,3-dipropil-8- ciclopentilxantina (DPCPX) bloquearam a inibição da exocitose de ACh em tempo real por PNU282987. Estes dados indicam que a adenosina é o gliotransmissor envolvido no controle da liberação de ACh, via ativação de receptores A1. Por outro lado, infelizmente, não conseguimos prevenir o efeito inibitório do agonista PNU 282987 na quantificação direta de ACh marcada na presença do inibidor seletivo de PLC, U73122, bem como obtido com o inibidor do receptor IP3, 2-APB, o que dificultou a investigação das vias moleculares que envolvem a liberação de adenosina via RCNn-?7. Conclusão: No primeiro artigo, os dados indicam que a facilitação neuromuscular pelos receptores de adenosina A2A e colinérgicos M1 é altamente dependente da atividade do transportador de colina de alta afinidade. No segundo artigo, os resultados sugerem que RCNn- ?7 das CS controlam a liberação de ACh da sinapse neuromuscular, favorecendo a saída de adenosina via ENT1 e ativando receptores inibitórios pré-sinápticos A1. No entanto, é necessário elucidar quais determinantes moleculares estariam envolvidos na ativação dos RCNn-?7 e na liberação de adenosina para o meio extracelular pelas CS. Além disso, os dois trabalhos jogam um novo foco sobre os efeitos gerados por agentes anticolinesterásicos na transmissão neuromuscular, posto que, após estes estudos, não seria mais possível afirmar que os efeitos de tais agentes estão vinculados somente ao acúmulo de ACh na fenda sináptica, já que os níveis de colina também reduzem em tais circunstâncias. Assim, os baixos níveis de colina também poderiam ser responsáveis pelos efeitos dos agentes anticolinesterásicos sobre a transmissão neuromuscular.