Efeitos de naringenina na biossíntese de lignina e tricin em raízes de milho (Zea mays L.)

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO –Depois da celulose, o composto orgânico mais abundante nas plantas é a lignina, um polímero formado, principalmente, pela polimerização de três monolignóis (álcoóis p-cumarílico, coniferílico e sinapílico), os quais variam no grau de metoxilação, além de uma diversidade menor de outros componentes secundários. Após a polimerização, estes monolignóis são convertidos em unidades monoméricas denominadas p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) e siringil (S), respectivamente. Além destas unidades, o flavonoide tricin tem sido apontado como um novo monômero iniciador do processo de lignificação. Numa reação catalisada pela chalcona sintase (CHS), tricin é formado pela condensação de p-cumaroil-CoA, proveniente da via de fenilpropanoides, com malonil-CoA proveniente da via do malonato. O produto desta reação, naringeninachalcona é convertido em naringenina, pela ação da chalconaisomerase. Naringenina é oxidada pela enzima flavona sintase (FNSII) formando apigenina e, subsequentemente, luteolina, tricetina, selgine, finalmente, tricin. Além de intermediário da via de biossíntese de tricin, naringeninatem sido descrito como um inibidor da 4-hidroxicinamoil-CoA ligase(4-CL), enzima- chave da via de fenilpropanoides, a qual leva à produção de lignina nas plantas.A biomassa lignocelulósicaé considerada um recurso renovável com potencial para a produção de biocombustíveis, porém a presença da lignina, fortemente ligada aos polissacarídeos celulose e hemicelulose, limita a digestibilidade enzimática durante os processos de hidrólise. A presença detricincomo componente da estrutura de lignina poderá ampliar ainda mais a diversidade no uso da lignina como matéria-prima para diversos produtos e, possivelmente, a melhora da sacarificação enzimática. OBJETIVOS – Diante do descrito acima, o objetivo geral deste trabalho foi investigar os efeitos de naringenina nos processos de biossíntese de lignina e de tricin, e na digestibilidade das raízes de milho. Para isso, o trabalho foi dividido em duas partes. Na primeira etapa, as plântulas foram cultivadas em hidroponia por 24 horas e os ensaios realizados para avaliar os efeitos de narigenina no crescimento, nos teores de lignina e sua composição monomérica, e na formação de tricin nas raízes. Na segunda etapa, as plântulas foram crescidas por 24 horas com naringenina associada com inibidores das vias de fenilpropanoides e tricin. O crescimento das raízes, lignina e sua composição monomérica, ácidos ferúlico e p-cumárico esterificados à parede celular e a digestibilidade foram monitoradas. MÉTODOS– Sementes de milho (Zeamays L. cv IPR-114) foram higienizadas com hipoclorito de sódio a 2% por 5 min, enxaguadascom água deionizada e germinadas a 25°C em duas folhas de papel germitestumedecido.Vinte e cinco plântulas de tamanhos uniformes foram sustentadas por uma placa de acrílico ajustável, e as raízes mergulhadas em um recipiente de vidro de 10 x 16 cm contendo 200 mL de solução nutritiva Dong(pH 6,0) sem ou com naringenina (0,1 a 0,3 mM).Inibidores da via de fenilpropanoidesforam aplicados isoladamente ou em associações com naringenina 0,2 mM. Os inibidores utilizados foram ácido piperonílico (PIP 0,1 mM; inibidor dacinamato 4-hidroxilase – C4H), ácido 3,4 metilenodioxicinâmico (MDCA 2,0 mM; inibidor da 4-CL), ácido protocatecuico (PROTO 0,5 mM; inibidor dap-hidroxicinamoil- CoA:chiquimato/quinatop-hidroxicinamoil transferase– HCT) e ácido 2,4 piridinodicarboxílico (PDCA 0,05 mM; inibidor da FNSII). Os recipientes foram mantidos em câmara de germinação (25ºC, fotoperíodo 12/12 horas claro/escuro, com densidade de fluxo de fótons de 280 ?mol m-1 s-1) durante 24 horas.As raízes foram medidas antes da incubação e no final dos experimentos, e a variação do comprimento foi obtida pela diferença entre eles. A biomassa fresca foi determinada imediatamente após a incubação e a biomassa seca após secagem em estufa a 60oC.O conteúdo de lignina, as atividades da 4-CL e a digestibilidade foram avaliados por espectrofotometria, enquanto a taxa de depleção de naringenina, a composição monomérica de lignina e os teores dos ácidos ferúlico e p-cumárico foram determinados cromatograficamente (HPLC). Os testes de Dunnett e Scott-Knottforam aplicados para avaliar as diferenças entre os parâmetros e valores de p ? 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. RESULTADOS E DISCUSSÃO– Os resultados revelaram que1) naringeninaé rapidamente depletado da solução nutritiva, um indicativo de que é absorvido pelas raízes de milho durante 24 horas. 2) Naringenina reduziuo comprimento e as biomassas frescas e secas das raízes, em comparação com os respectivos controles. Estes resultados estão em concordância com achados descritos em Arabidopsis, arroz, espinafre, alface, rabanete, tomate, cenoura e soja. 3) Naringenina aumentouo teor de lignina nas raízes, em comparação com o controle. O fato de que naringenina estimula a produção de lignina devido à redução do crescimento das raízes foi também constatado em soja. Neste aspecto, aredução do crescimento das raízes tem sido associada com a lignificação prematura das paredes celulares, o que ocorre quando a expansão celular diminui, quer quando a célula está sob estresse ou quando ocorre diferenciação como no caso do xilema. Como uma consequência do aumento da lignina, a composição monomérica também foi afetada pela naringenina, ou seja, redução dos teores do monômero G, sem alterar os monômeros H e S e soma H+G+S. Diante disso, um aumento na razão S/Gfoi notado, o que sugere um maior número de subestruturas ?-O-4, mais simples, o que pode tornar os tecidos radiculares macios e passíveis de degradação. 4) Naringenina não alterou a atividade da 4-CL quando aplicada isoladamente ou em conjunto com PIP, porém aumentou a atividade da 4-CL quando aplicada em conjunto com seu inibidor MDCA. Este aumento de atividade enzimática está em concordância com a produção de lignina causada pela naringenina, que assim potencializa o efeito do MDCA. 5) Naringenina aumentou a produção de tricin nas raízes; um indicativo de que o flavonoide deve estar atuando na formação de tricin, já que ele é um metabólito da via de biossíntese do flavonoide.6) Isoladamente, PIP, MDCA, PROTOe PDCA inibiram a produção de tricin nas raízes. Quando aplicado juntamente com estes inibidores enzimáticos,naringeninarestabeleceu a formação de tricin.7) PIP, MDCA e PROTO reduziram o crescimento das raízes, enquanto PDCA não causou nenhum efeito. 8) Isoladamente, todos os inibidores enzimáticos reduziram a produção de lignina. Naringenina restabeleceu a produção de lignina quando associado com PIP, MDCA ou PDCA, mas não com PROTO.9) Com respeito à composição monomérica de lignina, os resultados mais expressivos revelam que MDCA e MDCA+NAR (naringenina) reduziram drasticamente os monômeros e, como consequência, as somas H+G+S e as proporções H:G:S, embora não tenham afetado as razões S/G; um indicativo de que, ao menos nas raízes de milho, a deslignificação não seria comprometida por este inibidor enzimático. Por seu lado, PDCA não afetou os teores de G e S, a soma H+G+S, a proporção H:G:S e a razão S/G. Entretanto, a associação PDCA+NAR aumentou os teores dos três monômeros e a soma H+G+S alterando a proporção H:G:S, o que mais uma vez reforça o papel de naringenina como crucial precursor da via de biossíntese de tricin. 10) Os teores de ácido ferúlicoaumentaram (NAR, PROTO, PROTO+NAR; PDCA e PDCA+NAR), não foram alterados (PIP e PIP+NAR) e foram drasticamente reduzidos (MDCA; MDCA +NAR). Os teores de ácido p-cumárico aumentaram (PROTO; PROTO+NAR; PDCA), não foram alterados (PDCA+NAR) e foram reduzidos (NAR; PIP; PIP+NAR;MDCA; MDCA +NAR). Finalmente, 11) o pré-tratamento alcalino das raízes revelou que, após 6 horas, a digestibilidade aumentou 12% (MDCA), 37% (PDCA) e 12% (PDCA+NAR) e foi reduzida em 26% (PROTO+NAR). Resultados similares foram obtidos após 24 horas de digestão enzimática, ou seja, aumentos de 10% (MDCA), 36% (PDCA) e 11% (PDCA+NAR) e redução de 10% (PROTO+NAR). Ofato marcante observado foi com respeito aos inibidores MDCA e PDCA; ambos aumentaram a digestibilidade, especialmente PDCA. Aumento da digestibilidade da biomassa de milho, pelo MDCA, tem sido constatado em nosso laboratório (dados não publicados), mas o mecanismo de ação é desconhecido. Não há, também, uma clara explicação para o efeito do PDCA sobre a digestibilidade. É possível que a enzima FNSII desempenhe papel crucial na deposição de lignina ligada a tricin na parede celular de monocotiledôneas, pois a deficiência de tricin é parcialmente compensada pela incorporação de naringenina na estrutura da lignina, seguido por aumento na digestibilidade. CONCLUSÕES– Em resumo, o conjunto de resultados obtidos neste trabalho abre novas pistas quanto ao papel de naringenina nas duas vias metabólicas. Atuando como um inibidor da via de fenilpropanoides, naringenina afeta o crescimento das raízes de milho seguido por aumento de lignina e alteração na composição monomérica; uma característica relacionada à prematura lignificação das paredes celulares, e típica da ação, em geral, de aleloquímicos. Atuando como substrato da enzima FNSII, naringenina ativa a formação de tricin; um iniciador do processo de lignificação em monocotiledôneas. Neste aspecto, o papel do PDCA (inibidor da FNSII na via de tricin) no processo de produção de bioetanol a partir de milho e outras monocotiledôneas pode ser uma pista interessante a ser investigada

ABSTRACT: INTRODUCTION – After the cellulose, the most abundant organic compound in plants is the lignin that is formed by the polymerization of three monolignols (p-coumaryl, coniferyl and sinapyl alcohols), which vary in their degree of methoxylation, and other minor components. After polymerization, these monolignols are converted to p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) and syringyl (S) units, respectively. In addition to these units, the flavonoid tricin has been appointed as a new monomer that initiates the lignification process in monocots. By action of the chalcone synthase (CHS), tricin is formed by the condensation of p-coumaroil-CoA from the phenylpropanoid pathway, and malonyl-CoA from the malonate pathway. The reaction product, naringenin chalcone is converted in naringenin by the chalcone isomerase. After, naringenin is oxidized by the flavone synthase (FNSII) forming apigenin and, subsequently, luteolin, tricetin, selgin and tricin. In addition to their role as a metabolite of the tricin biosynthesis, naringenin has been described as an inhibitor of 4-hydroxycinnamoyl-CoA ligase (4-CL), a key enzyme of the phenylpropanoid pathway; an important route for the production of lignin in plants. Due to this, lignocellulosic biomass is considered a renewable resource with potential for the production of biofuels, but the presence of lignin, strongly linked to polysaccharides cellulose and hemicellulose, limits the enzymatic digestibility during the hydrolysis processes. Thus, the presence of tricin as a structural component of lignin needs be studied to increase the diversity in the use of this polymer as a raw material for various products, and possibly to improve the enzymatic saccharification. AIMS – In view of the above described, the general objective of this work was to investigate the effects of naringenin on the biosynthesis of lignin and tricin, and the digestibility of maize roots. For this, the work was carried out in two steps. In the first, the seedlings were cultivated in hydroponics for 24 hours and the assays were made to evaluate the effects of naringenin on root growth, contents of lignin and its monomeric composition, and tricin production. In the second step, the seedlings were grown under the action of naringenin jointly with inhibitors of the phenylpropanoid and tricin pathways. The root growth, lignin contents and monomer composition, contents of ferulic and p-coumaric acids esterified to the cell wall, and digestibility of roots were monitored. METHODS – Maize (Zea mays L. cv. IPR-114) seeds were sanitized with 2% sodium hypochlorite for 5 min, rinsed extensively with deionized water, and dark-germinated at 25°C on two sheets of moistened filter paper. Twenty-five three-day-old seedlings of uniform size were then supported by an adjustable acrylic and dipped into a 10 ? 16 cm glass container filled with 200 mL of nutrient solution (pH 6.0) with or without naringenin (0.1 to 0.3 mM). Inhibitors of the phenylpropanoid and tricin pathways were appliedalone or jointly with naringenin 0.2 mM.The used inhibitors were piperonylic acid (PIP 0.1 mM; inhibitor of cinnamate 4-hydroxylase –C4H),3,4-(methylenedioxy)cinnamic acid (MDCA, 2.0 mM; inhibitor of 4-CL), protocatechuic acid (PROTO 0.5 mM; inhibitor of p-hydroxycinnamoyl-CoA:shiquimate/quinate p- hydroxycinnamoyl-CoA transferase – HCT) and 2,4-pyridinedicarboxilic acid (PDCA 0.05 mM; inhibitor of FNSII).The containers were kept in a growth chamber for 24 h at 25°C, with a light/dark photoperiod of 12/12 h and a photon flux density of 280 ?mol m?2 s?1.Roots were measured before incubation and at the end of experiments, and the variation in length was obtained by the difference among them. Fresh root weight was determined immediately after incubation, and the dry weight was estimated after oven-drying at 60oC until it reached a constant weight. The lignin content, activities of 4-CL and digestibility were determined spectrophotometrically, whereas the naringenin depletion rate, lignin monomeric composition and the contents of ferulic and p-coumaric acidswere assayed by high performance liquid chromatography (HPLC). The Dunnett and Scott-Knott tests were applied to evaluate the differences between parameters and pvalues ? 0.05 were considered statistically significant. RESULTS AND DISCUSSION – The results revealed that 1) naringenin is rapidly depleted of the nutrient solution; an indicative that it is absorbed by maize roots for24 hours. 2) Naringenin reduced the length and fresh and dry weights of roots, compared to the respective controls. These results agree with findings reported in Arabidopsis, rice, spinach, lettuce, radish, tomato, carrot, and soybean. 3) Naringenin increased the lignin content in roots, in comparison to the control. The fact that naringenin stimulates the lignin production due to the reduction of root growth was also observed in soybean. In this regard, the reduction of root growth has been associated with the premature lignification of cell walls, which occurs when cell expansion decreases, either when the cell is under stress or when differentiation occurs in the xylem. Because of the reduction of lignin, the monomeric composition was also affected by naringenin, i.e., reduction of the G monomer contents without altering the H and S monomers and the sum H + G + S. Therefore, an increase in the S/G ratio was noted suggesting a larger number of simpler ?-O-4 substructures, which makes the roots more flexible and degradable. 4) Naringenin did not alter the activity of 4-CL when applied alone or jointly with PIP but increased it when applied jointly with the inhibitor MDCA. This increase in enzymatic activity agrees with the production of lignin caused by naringenin, which potentiates the effect of MDCA. 5) Naringenin increased the production of tricin in the roots; an indicative that the flavonoid acts in the formation tricin biosynthesisbecause it is a metabolite of the flavonoid biosynthetic pathway. 6) Alone, PIP, MDCA, PROTO and PDCA inhibited the production of tricin in roots. When applied jointly with these enzymatic inhibitors, naringenin restored the tricin formation. 7) PIP, MDCA and PROTO reduced the root growth, while PDCA had no effect. 8) Alone, all enzyme inhibitors reduced the lignin production. Naringenin restored the lignin production when associated with PIP, MDCA or PDCA, but not jointly with PROTO. 9) With respect to the lignin monomeric composition, the striking data show that MDCA and MDCA+NAR (naringenin) drastically reduced all monomers and, as a consequence, the H+G+S and H:G:S ratio, although have not affected the S/G ratio; an indicative that, at least for maize roots, delignification would not be compromised by this enzyme inhibitor. On the other hand, PDCA did not affect the contents of G and S, the H+G+S, H: G:S, and S/G ratio. However, the mixture PDCA+NAR increased the contents of the monomers and H+G+S,changing the H: G:S ratio, and reinforcing the role of naringenin as a crucial precursor of the tricin biosynthesis.10) The levels of ferulic acid increased (NAR, PROTO, PROTO+NAR, PDCA and PDCA+NAR), were not altered (PIP and PIP+NAR) and were drastically reduced (MDCA; MDCA+ NAR). The levels of p-coumaric acid increased (PROTO; PROTO+NAR; PDCA), were not altered (PDCA+NAR) and were reduced (NAR; PIP; PIP+NAR; MDCA; MDCA+NAR). Finally, 11) alkaline root pretreatment revealed that, after 6 hours, the digestibility increased 12% (MDCA), 37% (PDCA) and 12% (PDCA+NAR), and was reduced by 26% (PROTO+NAR). Similar results were obtained after 24 hours of enzymatic digestion, i.e.,increases of 10% (MDCA), 36% (PDCA) and 11% (PDCA+NAR), and a reduction of 10% (PROTO+NAR). As noted, both MDCA and PDCA inhibitorsincreased the root digestibility, especially PDCA. Increased digestibility of the maize biomass by MDCA has been observed in our laboratory (unpublished data), but the mechanism of action is unknown. It is possible that FNSII enzyme plays a crucial role in the deposition of tricin-bound lignin in the monocots cell wall since tricin deficiency is partially compensated by the incorporation of naringenin into the structure lignin, followed by increased digestibility. CONCLUSIONS – Overall, the set of results obtained in this work opens new clues about the role of naringenin in the two metabolic pathways. Acting as an inhibitor of the phenylpropanoid pathway, naringenin affects the maize root growth followed by increased lignin and altered monomeric composition; a characteristic related to the premature lignification of the cell walls, and typical of the action, in general, of allelochemicals. Acting as substrate of the enzyme FNSII, naringenin activates the formation of tricin; an initiator of the lignification process in monocots. In this regard, the role of PDCA (as an inhibitor of FNSII in the tricin pathway) in the process of bioethanol production from maize and other monocots can be an interesting road to be covered