Efeito da associação anetol+intraconazol sobre a artrite experimental induzida por Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A paracoccidioidomicose (PCM) consiste em uma micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidiodes brasiliensis, sendo considerada a infecção fúngica de maior importância na América Latina. A infecção pode provocar lesões principalmente nos pulmões, mas também em outros tecidos como as articulações originando a artrite séptica. O tratamento é feito com itraconazol (IT), em monoterapia por um período prolongado, até que seja evidenciada a eliminação do agente etiológico, podendo provocar efeitos adversos nos pacientes, desde reações leves como desconfortos gastrintestinais até reações graves como lesões hepáticas. O uso de produtos naturais que apresentam efeitos terapêuticos favoráveis, porém com menores efeitos adversos, vem ganhando maior atenção no tratamento de diversas doenças. O anetol (AN), um composto natural extraído do anis estrelado (Illicium verum), apresenta diversas atividades biológicas, sendo suas atividades antimicrobiana, anti-inflamatória e antinociceptiva, já bem comprovadas. Diversos estudos experimentais demonstram que a associação de fármacos e compostos naturais pode atuar com sinergismo, melhorando a eficácia farmacológica dos mesmos, com doses bastante reduzidas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficácia do tratamento com o AN e a associação anetol+itraconazol (AN+IT) na artrite induzida por P. brasiliensis; comparativamente ao tratamento com o itraconazol (IT). MATERIAIS E MÉTODOS: Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, machos, com 45 a 60 dias de vida, pesando 180 -200 g no início dos experimentos. Os animais foram mantidos em ambiente adequado com temperatura controlada (22 ± 2º C), ciclo claro-escuro de 12 h, com livre acesso à ração padrão e água. O protocolo para estes experimentos foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Estadual de Maringá sob número de homologação de CEAE/UEM 125/2010. A artrite séptica foi induzida pela injeção intra-articular, de 100 ?l da suspensão de P. brasiliensis - Pb18 na concentração de 105 células leveduriformes viáveis, no joelho direito da pata posterior de ratos. O joelho esquerdo recebeu apenas PBS. A evolução das manifestações clínicas induzidas pelo P. brasiliensis foi avaliada no 3º, 7º, 14º e 21º dias após a indução da artrite (AIP). Os parâmetros avaliados foram: o desenvolvimento do edema de joelho, o número de leucócitos recrutados na cavidade articular, o peso corporal dos animais, a concentração plasmática de óxido nítrico, a concentração de TNF no exsudato articular do joelho, a capacidade de marcha, a produção de anticorpos anti-Pb e a atividade de transaminases plasmáticas (AST e ALT). O produto de dissecção da articulação do joelho direito da pata posterior de cada animal foi processado para análises histológicas utilizando técnicas de coloração Hematoxilina-eosina e Grocott. Após estabelecido o período em que as manifestações da AIP foram mais graves (14º dia após a infecção), foi iniciado o tratamento dos animais. Para isto, os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos: controle, artrítico, e artríticos tratados com IT (doses 12,5, 25 e 50 mg/Kg), AN (doses de 62,5, 125 e 250 mg/Kg) e a associação de AN+IT (doses de 62,5 e 12,5 mg/Kg, respectivamente). O tratamento foi realizado por via oral (gavagem), em dose única diária, por um período de 14 dias. RESULTADOS E DISCUSSÃO: P. brasiliensis promoveu um processo infeccioso na articulação do joelho do animal com formação de edema a partir do 3º dia de infecção, evoluindo até o 21º dia. Durante o período de infecção outros parâmetros se apresentaram alterados: ocorreu um aumento do número de leucócitos no local da infecção, um aumento na concentração plasmática de NO, na concentração de TNF tecidual e de anticorpos anti-Pb, além de uma diminuição da mobilidade do animal. A análise histológica utilizando a técnica de HE mostrou alterações morfológicas na articulação do joelho do animal infectado, com grande infiltrado celular e degradação articular. Adicionalmente foi evidenciado, pela avaliação histológica utilizando coloração de Grocott, a presença do fungo na membrana sinovial da articulação. Os animais não apresentaram variação de peso ou alteração nas enzimas hepáticas, mas a distância percorrida no teste de marcha diminuiu quando comparados aos animais normais, evidenciando um quadro infeccioso intenso, acompanhado de um processo inflamatório. O tratamento com IT, em todas as doses testadas, reduziu a infecção diminuindo o edema articular, o recrutamento celular, a concentração plasmática de NO e anti-Pb, melhorando a marcha dos animais. O IT reduziu significativamente a concentração de TNF tecidual somente na dose de 50 mg/kg. Além disso, as análises histológicas mostraram que o IT reduziu o infiltrado inflamatório na membrana sinovial e a degradação articular do joelho. O AN em todas as doses testadas inibiu o edema das articulações, o recrutamento celular no local da infecção e melhorou a marcha dos animais. A redução da concentração de NO e a prevenção da degeneração da cartilagem da articulação do joelho, somente foi observada quando dose maior de AN (250 mg/kg) foi utilizada. A associação de AN+IT promoveu melhora em todos os parâmetros da infecção, ou seja, reduziu o edema, o recrutamento de leucócitos, a concentração de NO, TNF e anti-Pb. A associação de AN+IT também melhorou a mobilidade dos animais, aumentando a distância percorrida e com isso preveniu a degradação da cartilagem. CONCLUSÃO: A artrite séptica induzida pela inoculação do fungo P. brasilensis na articulação do joelho do animal, se apresenta como uma resposta infecciosa local bastante intensa, acompanhada de uma resposta inflamatória, no 14? dia após a indução. Os tratamentos com o IT em monoterapia, nas doses de 12,5; 25, 50 mg/kg, e com a associação AN + IT em doses bem menores (62,5+12,5 mg/kg), mostraram um efeito inibitório similar sobre o desenvolvimento da artrite. O AN em monoterapia, mesmo em doses alta (250 mg/kg), não apresentou a mesma eficácia farmacológica, quando comparado ao IT e a associação AN + IT, neste modelo experimental

ABSTRACT: INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidiodes brasiliensis, being considered the most important fungal infection in Latin America. The infection can cause damage mainly to the lungs, but also to other tissues such as the joints leading to septic arthritis. Treatment with itraconazole (IT) monotherapy for a prolonged period until elimination of the etiologic agent is evident and may cause adverse effects on patients, from mild reactions such as gastrointestinal discomfort to severe reactions such as liver damage. The use of natural products that have favorable therapeutic effects, but with less adverse effects, has been gaining more attention in the treatment of various diseases. Anethole (AN), a natural compound extracted from star anise (Illicium verum), has several biological activities, and its antimicrobial, anti-inflammatory and antinociceptive activities have been well proven. Several experimental studies show that the combination of drugs and natural compounds can act synergistically, improving their pharmacological efficacy at very low doses. The aim of the present study was to evaluate the effectiveness of AN treatment and the association of anethole + itraconazole (AN + IT) in arthritis induced by P. brasiliensis; compared to treatment with itraconazole (IT). MATERIALS AND METHODS: Male Wistar rats, 45 to 60 days old, weighing 180 - 200 g at the beginning of the experiments were used. The animals were kept in a suitable environment with controlled temperature (22 ± 2 ° C), 12 h light-dark cycle, with free access to standard feed and water. The protocol for these experiments was approved by the Animal Ethics Committee of Maringá State University under the approval number of CEAE / UEM 125/2010. Septic arthritis was induced by intra-articular injection of 100 ?l of the suspension of P. brasiliensis - Pb18 at a concentration of 105 viable yeast cells in the right knee of the rat hind paw. The left knee received only PBS. The evolution of the clinical manifestations induced by P. brasiliensis was evaluated on the 3rd, 7th, 14th and 21st days after arthritis induction (AIP). The parameters evaluated were: the development of knee edema, the number of leukocytes recruited in the joint cavity, the body weight of the animals, the plasma nitric oxide concentration, the concentration of TNF in the knee joint exudate, the walking ability, the production of anti-Pb antibodies and plasma transaminase activity (AST and ALT). The right knee joint dissection product of the hind paw of each animal was processed for histological analysis using Hematoxylin-eosin and Grocott staining techniques. After establishing the period in which the manifestations of AIP were most severe (14th day after infection), treatment of the animals was started. For this, the rats were randomly divided into groups: control, arthritic, and IT-treated arthritics (doses 12.5, 25 and 50 mg / kg), AN (doses 62.5, 125 and 250 mg / kg) and the association of AN + IT (doses of 62.5 and 12.5 mg / kg, respectively). The treatment was performed orally (gavage), in a single daily dose, for a period of 14 days. RESULTS AND DISCUSSION: P. brasiliensis promoted an infectious process in the knee joint of the animal with edema formation from the 3rd day of infection, progressing until the 21st day. During the period of infection other parameters were altered: there was an increase in the number of leukocytes at the site of infection, an increase in plasma NO concentration, tissue TNF concentration and anti-Pb antibodies, as well as decreased mobility of the animal. Histological analysis using the HE technique showed morphological changes in the knee joint of the infected animal, with large cellular infiltrate and joint degradation. Additionally, it was evidenced by the histological evaluation using Grocott staining, the presence of the fungus in the synovial membrane of the joint. The animals did not show weight variation or alteration in liver enzymes, but the distance covered in the gait test decreased when compared to normal animals, showing an intense infectious condition, accompanied by an inflammatory process. Treatment with IT at all doses tested reduced infection by decreasing joint edema, cell recruitment, plasma NO and anti-Pb concentration, and improving gait. IT significantly reduced tissue TNF concentration only at 50 mg / kg dose. In addition, histological analysis showed that IT reduced inflammatory infiltrate in the synovial membrane and knee joint degradation. AN at all doses tested inhibited joint edema, cell recruitment at the site of infection and improved gait. The reduction in NO concentration and the prevention of knee joint cartilage degeneration was only observed when a higher dose of AN (250 mg / kg) was used. The association of AN + IT improved all infection parameters, ie, reduced edema, leukocyte recruitment, NO, TNF and anti-Pb concentration. The association of AN + IT also improved the animals' mobility, increasing the distance traveled and thus preventing cartilage degradation. CONCLUSION: Septic arthritis induced by inoculation of the fungus P. brasilensis in the knee joint of the animal presents as a very intense local infectious response, accompanied by an inflammatory response, on the 14th day after induction. Treatments with IT alone, in doses of 12.5; 25, 50 mg / kg, and the combination of AN + IT at much lower doses (62.5 + 12.5 mg / kg), showed a similar inhibitory effect on the development of arthritis. AN alone, even at high doses (250 mg / kg), did not show the same pharmacological efficacy when compared to IT and the association AN + IT in this experimental model