Estudo do mecanismo fotoprotetor de diferentes abordagens terapêuticas sobre dano oxidativo induzido por radiação ultravioleta A e B

Abstract

RESUMO: 1. Introdução A pele humana funciona como uma barreira de proteção e mantém a homeostase. A exposição à radiação ultravioleta (UV) é responsável pelo envelhecimento prematuro da pele e pela carcinogênese, causada principalmente pela superprodução de espécies reativas de oxigênio (ERO). Há um interesse crescente por pesquisas sobre novas estratégias que abordem a prevenção do fotoenvelhecimento. Assim, nosso objetivo foi avaliar a atividade biológica e o mecanismo de ação de duas abordagens de tratamento em danos induzidos por radiação UV em modelos de cultura de células. Avaliamos o potencial da metformina em proteger as células de queratinócitos humanos HaCaT dos danos causados pela radiação UVB, bem como seu possível mecanismo de ação. Observamos que a metformina não mostrou atividade antioxidante intrínseca, mas foi capaz de reduzir a produção de ERO intracelular induzida por UVB e superóxido (O2•?) dependente de NADPH oxidase. Além disso, reduziu a fosforilação de ERK ½ e morte celular por apoptose. Esses resultados mostraram que este estudo traz evidências de que a metformina pode ser um promissor agente antienvelhecimento contra danos à pele induzidos pela radiação UVB. No outro estudo, fibroblastos L929 foram tratadas com nanoceria (100 nM) e expostas à radiação UVA. O pré-tratamento de células com nanoceria não mostrou citotoxicidade e protegeu as células da morte induzida por UVA, aumentando a viabilidade celular. Nanoceria também diminuiu a produção de ERO imediatamente após a irradiação ou por até 48 horas e ainda restaurou a atividade de SOD e GSH. Além disso, o tratamento com nanoceria impediu a apoptose, diminuindo os níveis de Caspase 3/7 e a perda de potencial da membrana mitocondrial. Nanoceria também aumentou significativamente a sobrevivência celular, aumentando a proliferação por 5 dias em comparação com as células não irradiadas e com células irradiadas por UVA e no ensaio de cicatrização de feridas. Além disso, verificou-se que a nanoceria diminuiu o envelhecimento celular e a fosforilação de ERK 1/2. Nosso estudo sugere que a nanoceria pode ser um potencial aliado das enzimas antioxidantes intracelulares para combater a foto-lesão induzida por UVA e, consequentemente, levar as células a mecanismos de sobrevivência e proliferação. Palavras-chave: nanopartícluas de óxido de cério, antioxidantes, metformina, radiação ultravioleta 2. Metodologias Os ensaios de atividade biológica e elucidação dos mecanismos de ação foram realizados com culturas de células de queratinócitos humanos da linhagem HaCaT e fibroblastos murinos L929. As células HaCaT foram tratadas com metformina e submetidas à radiação ultravioleta B. A metformina foi adquirida comercialmente da Sigma Aldrich (PHR1084). As células L929 foram tratadas com nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) e submetidas à radiação ultravioleta A. As nanopartículas de óxido de cério foram sintetizadas pelo grupo de pesquisa do Prof. Dr. Sudipta Seal da Universidade Central da Flórida (University of Central Florida, UCF, Orlando, USA). 2.1 Atividade biológica da metformina sobre queratinócitos HaCaT irradiados com UVB Com o objetivo de verificar o possível mecanismo de ação fotoprotetor e um possível envolvimento de atividade antioxidante, as células foram tratadas com 1 ?M de metformina, irradiadas com UVB (40 mJ/cm2) e processadas para os ensaios: citotxicidade e fotoproteção (MTT); ensaio do DPPH•, Xantina oxidase (XOD); produção de espécies reativas de oxigênio (H2DCF-DA), atividade da enzima NADPH oxidase; morte celular por apoptose (Anexina V/PI), fosfoforilação da proteína ERK 1/2 por Western blot. 2.2 Atividade biológica das nanopartículas de óxido de cério sobre fibroblastos L929 irradiados com UVA Com o objetivo de verificar o possível mecanismo de ação fotoprotetor, as células foram tratadas com 100 nM de nanoceria, irradiadas com UVA (30 J/cm2) e processadas para os ensaios: citotoxicidade e fotoproteção (MTT); produção de espécies reativas de oxigênio (H2DCF-DA), atividade da enzima intracelular superóxido dismutase (SOD) e os níveis de glutationa (GSH); ensaio de proliferação e cicatrização de ferida; envelhecimento (?-galactosidase) e morte celular por apoptose (nível de Caspases 3/7, potencial de membrana mitocondrial), envolvimento da via de sobrevivência MAPK ERK 1/2 (Western blot). 3. Resultados e discussão 3.1 Atividade fotoprotetora da metformina sobre queratinócitos HaCaT irradiados com UVB A metformina demonstrou evidências de sua atividade fotoprotetora na concentração de 1 ?M. Utilizando metodologias para elucidação do mecanismo de ação, verificamos importantes danos celulares induzidos pela radiação UVB, como o aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO), ativação da enzima NADPH oxidase, morte celular por apoptose e aumento da fosforilação da proteína ERK 1/2. Em relação à atividade antioxidante, a metformina dimimuiu os níveis de ERO. Curiosamente, verificamos que a metformina não apresentou atividade antioxidante intrínseca na concentração testada, mas sim agindo indiretamente sobre potenciais fontes de ERO, como a enzima NADPH oxidase, que é também responsável pela produção extendida de ERO após a irradiação. A produção extendida de ERO pode levar à ativação de vias que controlam a sobrevivência e morte celular, como a MAPK ERK 1/2. Estes resultados mostram evidências que podem servir como base para nossos estudos, de que a metformina pode ser uma nova abordagem para o tratamento de danos na pele causados pela radiação UVB. 3.2 Atividade fotoprotetora de nanopartículas de óxido de cério sobre fibroblastos L929 irradiados com UVA Nanoceria apresentou atividade antioxidante ao dimimuir os níveis de ERO e restaurar a atividade da enzima intracelular (SOD) e os níveis de GSH. Porém, também foi observado um aumento da proliferação celular, cicatrização de ferida, diminuição da morte celular por apoptose, diminuição da senescência e diminuição da fosforilação da MAPK ERK 1/2. Estes resultados mostram que além da atividade antioxidante, que já está bem estabelecida na literatura, o seu potencial regenerador pode ser explorado frente a danos causados pela radiação UVA. 4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS Os resultados obtidos neste trabalho trata-se de duas abordagens terapêuticas com diferentes mecanismos de ação em modelo de culturas de células da pele sob o dano induzido pela radiação ultravioleta A e B. Ambos não apresentaram potencial citotóxico nas células testadas, sendo que nanoceria ainda induziu a proliferação celular. Além disso, ambos apresentaram atividade antioxidante por diferentes mecanismos; Utilizando ensaios de mecanismo de ação, verificamos que a metformina e nanoceria reduziram os danos celulares oxidativos induzidos por UVA e UVB, que podem estar relacionados à morte celular por apoptose; Desta forma, é possível concluir que a metformina e nanoceria apresentaram uma promissora atividade fotoprotetora por diferentes mecanismos de ação, trazendo novas abordagens terapêuticas e servindo como base para outros estudos que envolvem sua aplicação no tratamento dos danos causados pela radiação ultravioleta

ABSTRACT: 1. Introduction Human skin works as a barrier of protection and maintains skin homeostasis. Exposure to ultraviolet radiation (UV) is responsible for premature skin aging and carcinogenesis mainly driven by overproduction of reactive oxygen species (ROS). There is a growing interest for research on new strategies that address the photoaging prevention. We evaluate metformin potential on protect HaCaT keratinocytes cells from UVB irradiation induced damage as well as it possible mechanism of action. We observed that metformin did not show intrinsic scavenging activity but was able to reduce UVB-induced intracellular ROS and NADPH oxidase-dependent superoxide (O2•?) production. Furthermore, reduced ERK 1/2 phosphorylation, NADPH oxidase activity and cell death by apoptosis. These results showed that MET might be a promising anti-photoaging agent against UV radiation induced skin damage. In the other study, fibroblasts cells L929 were treated with nanoceria (100 nM) and exposed to UVA radiation and assayed for cell viabilty, oxidative stress by evaluation of ROS production, SOD and GSH activity and cell death and proliferation. Pretreatment of cells with nanoceria showed no cytotoxicity and protected cells from UVA-induced death by increasing of cell viability. Nanoceria also decreased ROS production imediately after irradiation or for up to 48h and restored SOD and GSH activity. Additionally, nanoceria treatment prevented apoptosis by decreasing Caspase 3/7 levels and mitochondrial membrane potential loss. Nanoceria significantly improved cell survival by increasing of proliferation for 5 days compared with non-irradiated and in UVA-irradiated cells and in wound healing assay. Furthermore, it was found that nanoceria decreased cell aging and ERK 1/2 phosphorylation. Our study suggests that nanoceria might be a potential ally with the intracellular antioxidant enzymes to fight UVA-induced photodamage and consequently drive cells to survival and proliferate mechanisms. Thus, our objective was to evaluate the biological activity and mechanism of action of two approaches of treatment in UV radiation induced damage in cell culture models. Keywords: cerium oxide nanoparticles, antioxidant, metformin, ultraviolet radiation 2. Methodologies Biological activity and elucidation of mechanism of action assays were performed with HaCaT human keratinocyte and L929 murine fibroblastos cell cultures. HaCaT cells were treated with metformin and subjected to UVB radiation. Metformin was purchased commercially from Sigma Aldrich (PHR1084). The L929 cells were treated with cerium oxide nanoparticles (nanoceria) and subjected to UVA radiation. Cerium oxide nanoparticles were synthesized by research group of Prof. Dr. Sudipta Seal of the Central University of Florida (University of Central Florida, UCF, Orlando, USA). 2.1 Biological activity of metformin on UVB-irradiated HaCaT keratinocytes In order to verify the possible mechanism of photoprotective action, HaCaT cells were treated with 1 ?M of metformin, irradiated with UVB (40 mJ cm2) and processed for the antioxidante activity, cytotoxicity and photoprotection assays: MTT method; DPPH assay, Xanthine oxidase system (XOD); production of reactive oxygen species (H2DCF-DA), activity of NADPH oxidase enzyme; cell death (Annexin V/PI), ERK 1/2 protein phosphorylation by Western blot. 2.2 Biological activity of cerium oxide nanoparticles on UVA-irradiated L929 fibroblasts In order to verify the possible mechanism of photoprotective action, L929 cells were treated with 100 nM nanoceria, irradiated with UVA (30 J/cm2) and processed for the tests: cytotoxicity and photoprotection (MTT); production of reactive oxygen species (H2DCF-DA), activity of intracellular superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) enzymes; proliferation and wound healing assay; aging (?-galactosidase activity) and cell death by apoptosis (Caspases level 3/7, mitochondrial membrane potential), involvement of the MAPK ERK 1/2 survival pathway (Western blot). 3. Results and discussion 3.1 Photoprotective effect of metformin on UVB-irradiated HaCaT keratinocytes Metformin showed photoprotective activity at a concentration of 1?M. Using methodologies to elucidate the mechanism of action, we found important cellular damage induced by UVB radiation, such as increased levels of reactive oxygen species (ROS), activation of NADPH oxidase enzyme, apoptosis cell death and increased ERK 1/2 protein phosphorylation. Regarding antioxidant activity, metformin decreased ROS levels. Interestingly, we found that metformin showed no intrinsic antioxidant activity at the concentration tested, but rather indirectly acting on potential sources of ROS, such as the enzyme NADPH oxidase, which is also responsible for extended ROS production after irradiation. Extended production of ROS may lead to activation of pathways that control cell survival and death, such as MAPK ERK 1/2, that was reduced by metformin. These results show evidence that may serve as the basis for our studies that metformin may be a new approach for treating skin damage caused by UVB radiation. 3.2 Photoprotective activity of cerium oxide nanoparticles on UVA-irradiated L929 fibroblasts Nanoceria showed antioxidant activity by decreasing ROS levels and restoring the activity of intracellular enzymes (SOD and GSH). Moreover, increased cell proliferation, wound healing process, decreased apoptotic cell death and senescence, and decreased MAPK ERK 1/2 phosphorylation. These results show that in addition to the antioxidant activity, which is already well established in the literature, its regenerative potential can be exploited against UVA radiation damage. 4. Conclusions and perspectives The results obtained in this work provided data to study two therapeutic approaches with different mechanisms of action in skin cell culture model under damage induced by ultraviolet radiation A and B. Both showed no cytotoxic potential in the cells tested, and nanoceria still induced cell proliferation. In addition, both showed antioxidant activity by different mechanisms. Using assays to evaluate the mechanisms of action, we found that metformin and nanoceria reduced UVA and UVB-induced oxidative damage, which may be related to reduction in cell death by apoptosis. Thus, it can be concluded that metformin and nanoceria showed promising photoprotective activity by different mechanisms of action, bringing new therapeutic approaches and serving as a basis for other studies involving its application in the treatment of damage caused by ultraviolet radiation