Estudo das enzimas ciclomaltodextrina glucanotransferases: clonagem e expressão da CGTase de Bacillus firmus cepa 37 e imobilização da CGTase comercial por ancoragem e ligação covalente

Abstract

RESUMO: Ciclomaltodextrina glucanotransferases (CGTase) são utilizadas principalmente para a produção industrial de ciclodextrinas (CDs), entre as quais as principais são constituídas de seis (?-CD), sete (?-CD) ou oito (?-CD) unidades de -D-glicopiranosídeo unidas por ligações ?-(1,4). As CDs são capazes de formar complexos de inclusão e estabilizar um amplo espectro de substâncias. A estratégia de clonagem e expressão de CGTase recombinante é uma alternativa para obter uma produção da enzima CGTase com rendimento suficiente para que seja economicamente viável sua aplicação em processos industriais. A imobilização enzimática também pode ser empregada como alternativa para redução dos custos de produção de CDs, visto que a imobilização possibilita uso continuo e repetido da enzima, evitando o seu descarte na forma solúvel e a consequente perda enzimática. O objetivo deste trabalho foi viabilizar a produção de CDs por meio do estudo de enzimas CGTases, no qual foi isolado o gene da CGTase de Bacillus firmus cepa 37, sequenciado, clonado e expressado em Bacillus subtilis WB800 (artigo 1). Também foi imobilizada a CGTase comercial (Toruzyme® 3.0L) em sílica de porosidade controlada por meio dos métodos de ancoragem em superfície (SCGT-A) e ligação covalente (SCGT-LC) (artigo 2). Artigo 1: O gene da CGTase foi clonado no plasmídeo TOPO-TA®, o qual foi transformado em Escherichia coli DH5?. A subclonagem foi conduzida empregando o plasmídeo pWB980 e transformação em B. subtilis WB800. A atividade enzimática do extrato bruto da CGTase de B. subtilis WB800 recombinante foi de 1,33 µmol ?-CD/min/mL, ou seja, 7,4 vezes maior comparado com a atividade enzimática de extrato bruto de CGTase obtida da cepa selvagem. Após a purificação, a CGTase recombinante apresentou uma atividade enzimática de 157,78 µmol ?-CD/min/mL, enquanto que a atividade da CGTase da cepa selvagem foi de 9,54 µmol ?-CD/min/mL. Quando empregadas as condições ótimas de produção de CDs utilizadas para CGTase de B. firmus cepa 37, foi observado que as propriedades catalíticas das CGTases selvagem e clonada foram equivalentes. Portanto, a estratégia de clonagem e expressão de CGTase em B. subtilis WB800 foi eficiente, com produção de níveis de CGTase maiores comparados a cepa selvagem. Artigo 2: O método SCGT-A mostrou-se eficiente na imobilização da CGTase comercial, devido ao curto tempo de imobilização, nas condições otimizadas, foi possível imobilizar 89,63% de CGTase. A CGTase comercial imobilizada por SCGT-LC apresentou um rendimento de imobilização de 48,44%. Na presença de 10% de etanol, houve um aumento na produção de CDs totais de 60,97% e 34,90% para SCGT-A e SCGT-LC, respectivamente, comparado aos mesmos meios sem etanol. O emprego de SCGT-A foi mais eficiente comparado à SCGT-LC e enzima livre (CGT-L), pois, em 24 h de reação, SCGT-A produziu 70,49% e 18,15% a mais de CDs totais que SCGT-LC e CGT-L, respectivamente. A produção de CDs por 5 ciclos consecutivos mostrou que, apesar de haver uma grande produção de CDs totais no primeiro ciclo reacional para SCGT-A e SCGT-LC, esta produção reduziu progressivamente a partir do segundo ciclo operacional. As duas técnicas de imobilização avaliadas se mostraram simples, e a enzima após imobilizada apresentou boa performance. A maior produção de CDs observada nesta pesquisa, tanto empregando a técnica de clonagem gênica, quanto utilizando a imobilização enzimática, torna promissor o emprego das CGTases em processos industriais no Brasil

ABSTRACT: Cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase) are mainly used for industrial production of cyclodextrins (CDs), among which the main CDs consist of six (?-CD), seven (?-CD) or eight (?-CD) -D-glucopyranoside units linked by ?-(1,4) bonds. CDs are able to form inclusion complexes and stabilize a broad spectrum of substances. The strategy of cloning and expression of recombinant CGTase is an alternative for production of CGTase enzyme in sufficient yield so that its application in industrial processes is economically feasible. Enzyme immobilization can also be employed as an alternative to reduce the production cost of CDs, as the immobilization allows repeated and continuous use of the enzyme, preventing its disposal in the soluble form and consequent loss. The objective of this study was to make possible the production of CDs by CGTase enzymes, in which the CGTase gene from Bacillus firmus strain 37 was isolated, cloned and expressed in Bacillus subtilis WB800 (article 1). Commercial CGTase (Toruzyme® 3.0L) was also immobilized into controlled pore silica by internal surface anchoring (SCGT-A) and covalent bonding (SCGT-CB) methods (article 2). Article 1: The CGTase gene was cloned into plasmid TOPO-TA®, and transformed into Escherichia coli DH5?. Subcloning was performed using the plasmid pWB980 and transformed into B. subtilis WB800. The enzymatic activity of CGTase crude extract of recombinant B. subtilis WB800 was 1.33 ?mol ?-CD/min/mL, that is, 7.4 times higher than the enzymatic activity of crude extract of CGTase obtained from the wild strain. After purification, the recombinant CGTase had an enzymatic activity of 157.78 ?mol ?-CD/min/mL, while the CGTase activity of the wild-type strain was 9.54 ?mol ?-CD/min/mL. When using the optimum conditions of CD production used for CGTase of B. firmus strain 37, it was observed that the catalytic properties of the wild-type and cloned CGTases were equivalent. Therefore, the CGTase cloning and expression strategy in B. subtilis WB800 was efficient, with production of higher CGTase levels compared to the wild-type strain. Article 2: The SCGT-A method proved to be efficient in the immobilization of commercial CGTase due to the short immobilization time and, under optimized conditions, it was possible to immobilize 89.63% CGTase. Commercial CGTase immobilized by SCGT-CB presented an immobilization yield of 48.44%. In the presence of 10% ethanol, there was an increase in total CD production of 60.97% and 34.90% for SCGT-A and SCGT-CB, respectively, compared to the same media without ethanol. The use of SCGT-A was more efficient compared to SCGT-CB and free enzyme (CGT-F), because in 24 h of reaction, SCGT-A produced 70.49% and 18.15% more total CDs than SCGT-CB and CGT-F, respectively. The production of CDs for 5 consecutive cycles showed that, although there was a large production of total CDs in the first reaction cycle for SCGT-A and SCGT-CB, this production progressively reduced from the second operational cycle. The two immobilization techniques evaluated were simple, and the immobilized enzyme showed good performance. The higher CDs production observed in these studies, whether using the gene cloning technique or using enzymatic immobilization, makes the use of CGTase in industrial processes in Brazil promising