Efeitos metabólicos do diuron no fígado

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO O diuron [3-(3,4-dichlorofnil) -1,1-dimetillureia] é um herbicida seletivo, eficiente no controle de uma ampla variedade de plantas daninhas e gramíneas nas culturas de algodão, café, cana de açúcar e citros. É um eficiente inibidor da fotossíntese, bloqueando o sítio de ligação da plastoquinona ao fotossistema II, assim impedindo a transferência de elétrons para esse intermediário. Esse herbicida está disponível em várias formas e embalagens. Consequentemente, é onipresente no ambiente e há frequentemente riscos de contaminação humana e animal. A DL50 para o diuron é igual a 1,02 g/kg, com a morte ocorrendo por colapso respiratório. De fato, estudos mostram que o diuron interfere com a atividade respiratória das mitocôndrias de fígado de rato, agindo como um desacoplador da fosforilação oxidativa, além de bloquear o fluxo de elétrons no segmento do citocromo bc1 em mitocôndrias de leveduras. A inibição total da fosforilação oxidativa pode ter consequências letais para os animais, enquanto a inibição incompleta em vários graus é conhecida por causar diversos efeitos, especialmente metabólicos. Por exemplo, já foi relatado que o diuron inibe a absorção de glicose no intestino de ratos, um efeito que está diretamente ligado a diminuição da produção de energia. Além do mais, outros estudos demonstraram que o diuron inibe a gliconeogênese a partir de lactato + piruvato em hepatócitos isolados na concentração de 0,5 mM. Contudo, a relação entre a concentração deste herbicida e os efeitos causados por ele ainda não é conhecida, nem a maneira como o diuron afeta a gliconeogênese a partir de outros percursores, ou como afeta a glicólise, frutólise, ureagênese ou o consumo de oxigênio. Como um desacoplador e concomitante inibidor do fluxo de elétrons, o efeito do diuron sobre a atividade respiratória em células intactas pode ser tanto inibição quanto estímulo, dependendo do efeito predominante. OBJETIVOS Levando em consideração o que foi exposto acima, o objetivo do presente trabalho foi conduzir um estudo sistemático sobre os efeitos do diuron no metabolismo hepático. O sistema experimental utilizado foi a perfusão em fígado isolado de rato onde a microcirculação e a polaridade celular são preservadas bem como a integridade celular. MATERIAIS E MÉTODOS Ratos machos Wistar pesando entre 200–280 g foram utilizados e todos os procedimentos foram feitos de acordo com as diretrizes éticas aceitas mundialmente para experimentação animal, sendo previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Maringá (protocolo nº 1219290915). Foi utilizado o sistema de perfusão não-recirculante, livre de hemoglobina, usando tampão Krebs/Henseleit-bicarbonato (pH 7,4, albumina de soro bovino 25 mg%, saturado com uma mistura de oxigênio e dióxido de carbono 95:5). Todos os substratos e o diuron, este último solubilizado em dimetil sulfóxido, foram adicionados ao líquido de perfusão de acordo com os protocolos experimentais. Amostras do perfusado efluente foram coletadas e analisadas em relação ao conteúdo dos seguintes metabólitos: glicose, lactato, piruvato, amônia e ureia. A concentração de oxigênio foi monitorada polarograficamente. Os conteúdos hepáticos de nucleotídeos de adenina no fígado foram mensurados após clampeamento do fígado em nitrogênio líquido e extração com HCLO4. O extrato foi neutralizado com K2CO3 e AMP, ADP e ATP foram mensurados por cromatografia liquida de alta performance (HPLC). A respiração mitocondrial foi avaliada em mitocôndrias intactas isoladas de fígado de rato, usando dois substratos diferentes: glutamato e succinato. As velocidades de consumo de oxigênio na presença (estado III) ou na ausência (estado IV) de ADP foram medidas, assim como a o controle respiratório (RC). As atividades dos complexos I, II e IV foram analisadas em mitocôndrias rompidas por congelamento-descongelamento usando respectivamente NADH, succinato + rotenona e ascorbato + N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenodiaminodiidrocloreto (TMPD). Todas as atividades foram medidas polarograficamente. Por último, a atividade da ATPase mitocondrial foi medida em mitocôndrias intactas (acopladas e desacopladas) e rompidas. A reação foi iniciada com a adição de ATP 5 mM e foi interrompida com a adição de ácido tricloroacético 5% gelado. A atividade da ATPase foi avaliada pela liberação de fosfato inorgânico, através de ensaio colorimétrico. RESULTADOS E DISCUSSÃO No fígado isolado de rato, o diuron foi capaz de modificar o funcionamento de várias vias metabólicas. Na condição alimentada, a infusão de diuron provocou diminuição do consumo de oxigênio e da produção de piruvato e aumento da produção de lactato e aa liberação de glicose. A concentração de diuron capaz de provocar metade do estímulo máximo sobre a produção de lactato foi de 80 ?M. A razão lactato/piruvato foi substancialmente aumentada pelo diuron, como resultado do aumento simultâneo na produção de lactato e diminuição na produção de piruvato. A gliconeogênese a partir de lactato foi avaliada no fígado de animais em jejum e a introdução de diuron resultou em diminuição progressiva do consumo de oxigênio e da produção de glicose. Para ambos, as curvas da relação entre o efeito e as concentrações de diuron apresentaram formato de hipérbole invertida. A metade da inibição máxima na produção de glicose a partir de lactato pode ser esperada na concentração de diuron 152 ?M. A produção de piruvato a partir de lactato, por outro lado, não foi afetada durante a infusão do diuron, mas apresentou um aumento transitório após a interrupção da infusão. A infusão de frutose 2mM resultou, como esperado, em um pronunciado aumento no consumo de oxigênio e na produção de glicose. A introdução de diuron 500 ?M produziu uma rápida diminuição na produção de glicose e também uma imediata diminuição no consumo de oxigênio a níveis abaixo das taxas basais. A inibição da produção de glicose a partir de frutose mostrou uma relação bem definida de dependência da concentração de diuron e 50% de inibição pode ser esperado na concentração de 230 ?M. O consumo de oxigênio diminuiu linearmente com o aumento da concentração de diuron. A produção de lactato foi aumentada somente transitoriamente em todas as concentrações testadas e os efeitos na produção de piruvato foram mal definidos, sugerindo, contudo, uma pequena diminuição com 500 ?M. Em concentrações mais baixas de diuron, todavia, a produção de piruvato a partir de frutose se comportou da mesma forma que a produção de lactato, com aumentos transitórios. A gliconeogênese a partir de alanina foi avaliada no fígado de animais em jejum e a introdução de diuron levou a uma inibição no consumo de oxigênio, na produção de glicose e na produção de ureia; ao contrário, a produção de lactato, piruvato e amônia foram aumentadas. A maior parte do efeitos foi revertido após a interrupção da infusão de diuron. A inibição da produção de glicose a partir de alanina também mostrou uma relação bem definida de dependência da concentração e 50% de inibição pode ser esperado na concentração de 283 ?M. O aumento na produção de amônia atingiu o seu máximo na concentração de 200 ?M, com um pequeno declínio na concentração de 500 ?M. No fígado intacto, não foi observado estímulo no consumo de oxigênio em nenhuma das condições empregadas no presente trabalho. Esse fato sugere que, pelo menos em células intactas de fígado, a inibição do fluxo de elétrons e o desacoplamento ocorrem em concentrações similares. A avaliação dos níveis de nucleotídeos de adenina (AMP, ADP e ATP) foi feita em fígado de ratos alimentados e em jejum. No estado alimentado, o diuron na concentração de 500 ?M teve pouca influência no conteúdo de AMP, ADP e ATP. Esse evento pode ser justificado pelo fato da glicólise estar estimulada, um fenômeno compensatório capaz de prevenir a diminuição nos níveis de ATP. No jejum, contudo, os níveis de ATP foram reduzidos em 59%, os de ADP em 36% e os de AMP em 36,5%. Consequentemente, as razões ATP/ADP e ATP/AMP foram substancialmente reduzidas. Os experimentos mitocôndrias foram feitos usando dois substratos, succinato e glutamato. Com ambos os substratos o diuron inibiu o estado III da respiração (presença de ADP exógeno) e diminuiu o controle respiratório (velocidade do estado III/velocidade do estado IV). A inibição foi maior com o substrato glutamato (50% de inibição na concentração de 218 ?M) quando comparado com o succinato (42% em 500 ?M). O controle respiratório foi completamente abolido quando o glutamato foi o substrato, começando na concentração de 200 ?M. Com o succinato ainda houve algum controle na concentração de 500 ?M. Isto porque o estado IV da respiração foi aumentado pelo diuron quando o glutamato foi o substrato, fenômeno que foi ausente com o succinato. Finalmente, a respiração basal com o substrato não foi afetada pelo diuron. A atividade de enzimas ligadas à membrana foram medidas e foi mostrado que o diuron inibe o fluxo de elétrons pela inibição da NADH-oxidase e succinato-oxidase. As concentrações que produziram 50% de inibição foram 325 e 500 ?M, respectivamente. Por outro lado, não houve inibição da oxidação do ascorbato, cujo elétrons são desviados diretamente para o complexo IV da cadeia respiratória na presença de TMPD. A atividade da ATPase foi aumentada em mitocôndrias intactas de maneira quase linear até a concentração de 500 ?M. A atividade da ATPase também foi aumentada em mitocôndrias rompidas por congelamento- descongelamento. Contudo, a atividade da ATPase em mitocôndrias já desacopladas pelo 2,4-dinitrofenol não foi afetada. Os resultados obtidos em mitocôndrias de fígado corroboram os resultados previamente observados em mitocôndrias de levedura em que a diminuição da produção de energia pelo diuron é consequência direta da inibição do fluxo de elétrons, provavelmente a nível do citocromo bc1, e desacoplamento da fosforilação. CONCLUSÕES Os resultados do presente trabalho demonstraram que o diuron é capaz de modificar vários fluxos metabólicos relacionados ao metabolismo energético do fígado em perfusão isolado de rato. A faixa de concentração em que os efeitos do diuron ocorreram sugere que sua significância pertence provavelmente mais ao domínio da toxicologia e da sobredosagem. Neste caso, além da falta de glicose circulante pela inibição da gliconeogênese, pode-se esperar acidose devido ao excesso na produção de lactato, diminuição da detoxificação da amônia e dano celular devido a manutenção deficiente da homeostase. Alguns sinais gerais de toxicidade que foram observados em ratos tratados com diuron podem ser atribuídos, pelo menos em partes, aos efeitos do herbicida no metabolismo de energia

ABSTRACT: INTRODUCTION Diuron [3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethyllurea] is a selective herbicide, efficient in the control of a wide range of weeds and grasses in the cultures of cotton, coffee, sugar cane and citrus. It is an efficient inhibitor of photosynthesis by blocking the binding site of plastoquinone to the photosystem II, thus preventing the transfer of electrons to this intermediate. This herbicide is available in several forms and packages. Consequently, it is ubiquitous in the environment and there are frequently serious risks of human and animal contamination. The DL50 for diuron is equal to 1.02 g/kg, with death occurring allegedly by respiratory collapse. Diuron is also active on the respiratory activity of rat liver mitochondria because is acts as uncoupler of oxidative phosphorylation, besides blocking the electron flow at the cytochrome bc1 segment in yeast mitochondria. Strong inhibition of oxidative phosphorylation may have letal consequences to animals, whereas incomplete inhibition at various degrees is known to be the cause of several effects, especially metabolic ones. For example, diuron inhibited the active absorption of glucose in the intestine of mice, an effect that is directly linked to energy production impairment. Moreover, diuron inhibits gluconeogenesis from lactate + pyruvate in isolated hepatocytes at the concentration of 0.5 mM. However, no concentration dependence is known neither the way how diuron affects gluconeogenesis from other precursors, or how it affects glycolysis, fructolysis, ureagenesis and oxygen uptake. As an uncoupler and a concomitant inhibitor of electron flow the effect of diuron on the respiratory activity of the intact cell could be either inhibition or stimulation, depending on what effect predominates. AIMS Taking into account what was exposed above, the purpose of the present work was to conduct a systematic study on the effects of diuron on the hepatic metabolism. The experimental system was the isolated perfused rat liver in which the microcirculation and cell polarity is preserved in addition to the cell integrity. MATERIALS AND METHODS Male Wistar rats weighing 200–280 g were used in the experiments and all procedures were done in accordance with the worldwide accepted ethical guidelines for animal experimentation and were previously approved by the Ethics Committee of Animal Experimentation of the University of Maringá (protocol number 1219290915). Hemoglobin-free, non-recirculating perfusion was performed using Krebs/Henseleit-bicarbonate buffer (pH 7.4, 25 mg% bovine-serum albumin, saturated with a mixture of oxygen and carbon dioxide 95:5). Substrates and diuron, as a dimethylsulfoxide solution, were added to the perfusion fluid according to the experimental protocols. Samples of the effluent perfusion fluid were collected and analyzed for their metabolite contents: glucose, lactate, pyruvate, ammonia and urea. The oxygen concentration was monitored polarographically. The hepatic contents of the adenine nucleotides in the liver were measured after freeze-clamping the perfused liver and extraction with H3CLO4. The extract was neutralized with K2CO3 and AMP, ADP, and ATP were assayed by means of high-performance liquid chromatography (HPLC). The mitochondrial respiratory activity was evaluated in intact rat liver mitochondria using two different substrates: glutamate and succinate. The rate of oxygen uptake in the presence (state III) or in the absence (state IV) of ADP was measured, as well as the respiratory control ratio (RC). The activities of complexes I, II and IV were assayed in freeze-thawing-disrupted mitochondria by using respectively NADH, succinate + rotenone and ascorbate + N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride (TMPD). All activities were measured polarographically. Ultimately, the mitochondrial ATPase activity was measured in intact (coupled and uncoupled) and in freeze-thawing disrupted mitochondria. The reaction was started by the addition of 5 mM ATP and stopped by the addition of ice-cold 5% trichloroacetic acid. The ATPase activity was evaluated by measuring the release of inorganic phosphate using a colorimetric assay. RESULTS E DISCUSSION In the isolated perfused rat liver, diuron was able to modify the functioning of several metabolic routes. In the fed condition oxygen uptake and pyruvate production were diminished whereas lactate production and glucose output were increased in presence of diuron. Half-maximal stimulation of lactate production can be expected at a diuron concentration of 80 ?M. The lactate to pyruvate ratio was substantially increased by diuron as result of the simultaneous increase in lactate production and decrease in pyruvate production. Gluconeogenesis from lactate 2mM was assayed in the liver of fasted rats and the introduction of diuron resulted in progressive decreases in oxygen uptake and glucose production. Both presented similar concave up concentration dependences. Half-maximal inhibition of glucose production can be expected at the diuron concentration of 152 ?M. Pyruvate production, on the other hand, was not affected during diuron infusion, but it experienced a transient increase upon cessation of the infusion. The infusion of fructose 2mM resulted, as expected, in pronounced increases in glucose, lactate and pyruvate production and increases in oxygen consumption. The introduction of 500 ?M diuron produced a fast diminution of glucose production and also an immediate decrease in oxygen uptake to levels below the basal rates. Inhibition of glucose production shows a well-defined concentration dependence and 50% inhibition can be expected at the concentration of 230 ?M. Oxygen uptake decreased linearly with the diuron concentration. Lactate production was only transiently increased and the effects on pyruvate production were poorly defined, suggesting, however, a small inhibition. At lower diuron concentrations, however, pyruvate production behaved like lactate production, with transient increases. Gluconeogenesis from alanine 2,5 mM was assayed in the liver of fasted rats and the introduction of diuron led to inhibition of oxygen uptake, glucose production and urea production; whereas lactate, pyruvate and ammonia productions were increased. Most effects were reversible upon cessation of the diuron infusion. Inhibition of glucose production showed a well-defined concentration dependence and 50% inhibition can be expected at the concentration of 283 ?M. The increase in ammonia production reached its maximum at the concentration of 200 ?M, with a small decline at the concentration of 500 ?M. In the intact liver cell, stimulation of oxygen uptake was not observed under any of the conditions employed in the present work. This fact suggests that, at least in the intact liver cells, inhibition of electron flow and uncoupling occur at similar concentrations. The measurements of the levels of the adenine mononucleotides (AMP, ADP and ATP) were carried out in both livers from fed and fasted rats. In the fed state 500 ?M diuron had little influence on the AMP, ADP and ATP contents. This event can be justified by the fact that glycolysis was stimulated, a compensatory phenomenon able to prevent the decrease in the ATP levels. There was also no modification in the total AMP content in the fed state. In the fasted state, however, the ATP levels were reduced by 59%, those of ADP by 36% and those of AMP by 36.5%. In consequence, also, the ATP/ADP and ATP/AMP ratios were substantially decreased. The experiments with phosphorylating mitochondria were done using two substrates, namely succinate and glutamate. With both substrates diuron inhibited state III respiration (presence of exogenously added ADP) and decreased the respiratory control ratio (state III/state IV ratio). Inhibition was stronger with the substrate glutamate (50% inhibition at 218 ?M) when compared to succinate (42% at 500 ?M). The respiratory control ratio was completely abolished when glutamate was the substrate starting at the concentration of 200 ?M. With succinate there was still some control at the concentration of 500 ?M. The state IV respiration was increased by diuron when glutamate was the substrate, a phenomenon that was absent with succinate. Finally, basal substrate respiration was not affected at all by diuron. The membrane-bound enzymatic activities were measured and it was shown that diuron inhibited electron flow by inhibition of both the NADH-oxidase and the succinate-oxidase. The concentrations producing 50% of inhibition were 325 and 500 ?M, respectively. On the contrary, it did not inhibit the oxidation of ascorbate, whose electrons are diverted into the respiratory at the level of complex IV in the presence of TMPD. The ATPase activity in coupled mitochondria was increased by diuron in an almost linear manner up to the concentration of 500 ?M. The ATPase activity was also increased in freeze-thawing disrupted mitochondria. However the ATPase activity of mitochondria already uncoupled by 2,4-dinitrophenol was not affected. The results obtained with rat liver mitochondria corroborate previous observations in yeast mitochondria that energy production impairment of diuron is a consequence of direct inhibition of electron flow, probably at the cytochrome bc1 level, and uncoupling of phosphorylation. CONCLUSIONS The results of the present work demonstrate that diuron is able to modify several metabolic fluxes linked to energy metabolism in the isolated perfused rat liver. The concentration range at which the effects of diuron occur suggests that their significance belongs most probably to the domain of toxicology and overdosing. Besides the lack of circulating glucose due to gluconeogenesis inhibition, one can expect metabolic acidosis due to excess lactate production, impairment of ammonia detoxification and cell damage due to a deficient maintenance of its homeostasis. Some of the general signs of toxicity that were observed in diuron-treated rats can be attributed, partly at least, to the effects of the herbicide on energy metabolism