Investigação da atividade antitumoral de compostos heterociclicos de nitrogênio em células de câncer de próstata

Abstract

RESUMO: Introdução: Na América Latina e Caribe, o câncer de próstata é a principal causa de morte decorrente de câncer entre a população masculina. Entre os tratamentos convencionais estão a privação de andrógenos, prostatectomia, radioterapia e quimioterapia. No entanto, os tumores podem desenvolver resistência a castração e/ou sofrer metástases, o que torna estas intervenções limitadas e não-efetivas. Assim, é urgente a busca de novos compostos eficazes para estes pacientes. Nesse contexto, muitas substâncias têm sido testadas. Compostos com anéis heterocíclicos de nitrogênio, como as quinoxalinas e as pirazinas, destacam-se por apresentar um amplo espectro de atividade biológica, incluindo ação antitumoral. Além disso, as estruturas de pirazinas e quinoxalinas permitem variadas modificações, possibilitando a obtenção de uma ampla variedade de compostos com diferentes aplicações biológicas. Objetivos: O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade antitumoral in vitro de dez compostos de quinoxalina e pirazina em cultura de células humanas de câncer de próstata andrógeno-independente (PC3) e sua toxicidade em células epiteliais normais de próstata (RWPE-1). Os objetivos específicos foram analisar a viabilidade de células expostas aos derivados de quinoxalina e pirazina e identificar os compostos com atividade antitumoral; verificar alterações na morfologia sob microscopia ótica; observar o efeito na migração celular e verificar um possível estresse oxidativo que pode estar induzindo a morte celular. Materiais e métodos: Oito compostos com núcleo de quinoxalina e dois com núcleo de pirazina foram sintetizados e fornecidos pelo Prof. Diego Pereira Sangi, da Universidade Federal Fluminense. A viabilidade celular foi determinada pelos ensaios do MTT, vermelho neutro e azul de tripano. Para os demais experimentos, as células foram tratadas com 7-cloro-N-metil-3-(metilsulfonil)quinoxalin-2-amina com as concentrações de IC10 e IC50, 15.22 ?M e 28.45 ?M, respectivamente, com ou sem pré-incubação do antioxidante NAC. Foram observadas a morfologia e a migração das células, pelo ensaio de cicatrização de feridas, em microscópio invertido de contraste de fase. Foram mensurados a produção de H2O2, pela marcação com Amplex Red, e os níveis de tiois reduzidos, pelo DTNB. Em seguida, a detecção de peroxidação lipídica utilizou a marcação com DPPP. Ademais, foram realizados microscopia de fluorescência, para visualização do potencial de membrana mitocondrial (??m) por TMRE, e foram mensurados os níveis de ATP intracelular pelo kit luminescente CellTiter-Glo. A integridade da membrana celular foi determinada por PI em espectofluorímetro. Além disso, vesículas acidas de células vivas foram marcadas com Lysotracker Red e visualizadas em microscopia de fluorescência. Resultados e discussão: Apenas três dos dez compostos avaliados exibiram atividade em células PC3, sendo os compostos GSCB42, GSCB46, GSCB47 e, em menor intensidade, GSCB45, os quais são todos derivados de quinoxalina. Contudo, os compostos também apresentaram toxicidade em células RWPE-1. O padrão 2,3-substituintes em quinoxalina são conhecidos por proporcionar diferentes ambientes eletrônicos a molécula que influenciam na lipofilicidade e atividade dos compostos. O grupo metilsulfonil na posição 3 é o principal substituinte que difere os compostos GSCB42 (7-chloro-N-methyl-3-(methylsulfonyl)quinoxalin-2-amine), GSCB46 (N-metil-3-(metilsulfonil)quinoxalin-2-amina), GSCB47 (3-cloro-6-metil-2-(metilsulfonil)quinoxalina) e GSCB45 (N,7-dimethyl-3-(methylsulfonyl)quinoxalin-2-amine) dos demais, portanto, são os principais responsáveis pela atividade destes compostos. Já o grupamento amina na posição 2 não parece ter alguma influência nessa característica. O tratamento com o IC10 e o IC50 em células PC3 não causou alterações evidentes na morfologia, afetando apenas levemente o formato celular. No ensaio de cicatrização de feridas, GSCB42 não inibiu a proliferação das células para a área livre, o que sugere que o composto não exerce controle na inibição da metástase tumoral. Estresse oxidativo é caracterizado por um desbalanço entre espécies reativas e o sistema antioxidante. O excesso de ROS pode induzir várias respostas biológicas, incluindo a iniciação de vias de transcrição de sinais, danos ou reparos no DNA entre outros, que desencadeiam apoptose, autofagia, necrose ou a sobrevivência celular. O tratamento com GSCB42 aumentou consideravelmente a produção H2O2 (267.7% no IC50). No entanto, o composto não afetou os níveis de tiois reduzidos. Uma das consequências do estresse oxidativo é a peroxidação lipídica, que aumentou em um efeito dose dependente nas células tratadas, atingindo 325,1% no IC50. A pré-incubação com NAC foi capaz de reverter completamente o aumento nos níveis de ROS e a peroxidação lipídica. A mitocôndria é um dos principais alvos dos elevados níveis de ROS, podendo exercer um papel central na apoptose. Para mensurar os danos mitocondriais, foram avaliados o potencial de membrana mitocondrial e os níveis intracelulares de ATP. GSCB42 parece afetar apenas os níveis de ATP, com uma pequena elevação no tratamento com o IC50. Altos níveis da molécula podem ser encontrados durante a apoptose, podendo ser proveniente tanto da fosforilação oxidativa mitocondrial quanto de reações da glicólise. Para avaliar se a morte decorre de necrose, foi determinado a integridade da membrana celular. Os resultados mostraram rompimento das membranas nos tratamentos com IC10 e IC50 de GSCB42. Possivelmente esse rompimento decorra da peroxidação lipídica ocasionada pelos níveis elevados de ROS. Já a autofagia, que é caracterizada por um acumulo de autofagossomos e autolisossomos, foi verificada pela marcação de vesículas ácidas em células vivas pelo Lysotracker e visualização em microscópio de fluorescência. No entanto, não foram observadas diferenças na fluorescência de células controle ou tratadas. Dessa forma, o tratamento com GSCB42 provocou elevação nos níveis de ROS, com a consequente peroxidação lipídica, que por sua vez, pode ter contribuído para o rompimento da membrana plasmática. Assim, os resultados sugerem que a morte celular das células tratadas com GSCB42 decorre de apoptose, possivelmente por meio de apoptose extrínseca visto que houveram poucas alterações mitocondriais. Além disso, ocorreu necrose nas linhagens PC3 tratadas com o composto GSCB42. Conclusão: O "screening" possibilitou a identificação de quatro compostos com atividade antitumoral. O estresse oxidativo parece estar envolvido na morte celular e rompimento precoce da membrana. Estudos futuros são necessários para esclarecer a via de morte celular, assim como na modificação de novos compostos a partir destes, para potencializar a atividade antitumoral e aumentar a seletividade

ABSTRACT: Introduction: In Latin America and Caribbean, prostate cancer is the leading cause of cancer death among men. Conventional treatments include androgen deprivation, prostatectomy, radiation therapy, and chemotherapy. However, tumors may develop resistance to castration and/or metastases, which makes these interventions limited and non-effective. Thus, the search for new compounds effective for these patients is urgently needed. In this context, many substances have been tested. Compounds with heterocyclic nitrogen rings, such as quinoxalines and pyrazines, detach as having a broad spectrum of biological activity, including antitumoral. In addition, pyrazine and quinoxaline structures allow for varied modifications, making it possible to obtain a wide variety of compounds with different biological applications. Objectives: The objective of this study was to evaluate the in vitro antitumor activity of ten compounds of quinoxaline and pyrazine in culture of androgen-independent prostate cancer cells (PC3) and their toxicity in normal prostate epithelial cells (RWPE-1). Specific objectives were to analyze the viability of cells exposed to quinoxaline and pyrazine derivatives and to identify compounds with antitumor activity; to verify changes morphology under optical microscopy; to observe the effect on cell migration and to verify a possible oxidative stress, which may be inducing cell death. Materials and methods: Eight compounds with quinoxaline nucleus and two with pyrazine nucleus were synthesized and provided by Prof. Diego Pereira Sangi, from the Fluminense Federal University. Cell viability was determined by MTT, neutral red and trypan blue tests. For the remaining experiments, cells were treated with 7-chloro-N-methyl-3-(methylsulfonyl)quinoxalin-2-amine at concentrations of IC10 and IC50, 15.22 ?M and 28.45 ?M, respectively, with or without preincubation of NAC antioxidant. Morphology and cell migration were observed by the wound healing assay under inverted phase contrast microscopy. H2O2 production was measured using Amplex Red and reduced thiol levels by DTNB. Thereafter, detection of lipid peroxidation utilized DPPP marker. Moreover, fluorescence microscopy was performed to visualize the mitochondrial membrane potential (??m) by TMRE, and the intracellular ATP levels were measured by the CellTiter-Glo luminescent kit. Integrity of the cell membrane was determined by PI in a spectrofluorimeter. In addition, acidic vesicles from living cells were marked with Lysotracker Red and visualized under fluorescence microscopy. Results and discussion: Only four of the ten evaluated compounds exhibited activity in PC3 cells, the compounds GSCB42, GSCB46, GSCB47 and, to a lesser extent, GSCB45, all derived from quinoxaline. However, the compounds also showed toxicity in RWPE-1 cells. The 2,3-substituent pattern in quinoxaline is known to provide different electronic environments to the molecule that influence the lipophilicity and activity of the compounds. The methylsulfonyl group at the 3-position is the major substituent that differs GSCB42 (7-chloro-N-methyl-3- (methylsulfonyl) quinoxalin-2-amine), GSCB46 (N-methyl-3- (methylsulfonyl) quinoxalin- 2-amine), GSCB47 (3-chloro-6-methyl-2-(methylsulfonyl) quinoxaline) and GSCB45 (N, 7-dimethyl-3- (methylsulfonyl) quinoxalin-2-amine) from others, therefore, are the main responsible for the activity of these compounds. The 2-position amine group does not seem to have any influence on this characteristic. Treatment with IC10 and IC50 in PC3 cells did not cause obvious changes in morphology, only slightly affecting the cell format. In the wound healing assay, GSCB42 did not inhibit proliferation of the cells into the free area, which suggests that the compound exerts no control in inhibiting tumor metastasis. Oxidative stress is characterized by an imbalance between reactive species and antioxidant system. Excess ROS can induce various biological responses, including initiation of signal transcription pathways, DNA damage or repairs among others, which trigger apoptosis, autophagy, necrosis, or cell survival. Treatment with GSCB42 considerably increased H2O2 production (267.7% on IC50). However, compound did not affect reduced thiois levels. One of the consequences of oxidative stress is lipid peroxidation, which increased in a dose-dependent effect on treated cells, reaching 325.1% at IC50. Preincubation with NAC was able to completely reverse the levels of ROS and lipid peroxidation. Mitochondria are one of the main targets of high ROS levels and may play a central role in apoptosis. In order to measure mitochondrial damage, the mitochondrial membrane potential and intracellular ATP levels were evaluated. GSCB42 appears to affect only ATP levels, with a slight elevation in IC50 treatment. High levels of the molecule can be found during apoptosis, and may be derived from both mitochondrial oxidative phosphorylation and glycolysis reactions. To assess whether death results from necrosis, integrity of cell membrane was determined. The results showed rupture of the membranes in treatments with IC10 and IC50 of GSCB42. Possibly this disruption results from lipid peroxidation caused by elevated levels of ROS. Autophagy, which is characterized by an accumulation of autophagosomes and autolysosomes, was verified by marking acidic vesicles in living cells by Lysotracker and fluorescence microscopy. Nevertheless, no differences were observed in the fluorescence of control or treated cells. Therefore, treatment with GSCB42 caused elevation in ROS levels, with consequent lipid peroxidation, which in turn may have contributed to the rupture of the plasma membrane. Thus, results suggest that the cell death of cells treated with GSCB42 occurs due from apoptosis, possibly through extrinsic apoptosis since there were few mitochondrial alterations. In addition, necrosis occurred in PC3 lines treated with compound GSCB42. Conclusion: The screening allowed identification of four compounds with antitumor activity. Oxidative stress appears to be involved in cell death and early rupture of the membrane. Future studies are needed to clarify the cell death pathway, as well as modifying new compounds from these, to potentiate antitumor activity and increase selectivity