Efeitos de nanopartículas de óxido de alumínio (Al2O3) sobre o crescimento e metabolismo de lignina em plantas de soja (Glycine max L.)

Abstract

RESUMO: INTRODUÇÃO E OBJETIVOS – A nanotecnologia tem sido amplamente aplicada em diversos campos da ciência, especialmente nas áreas médica, farmacêutica, cosmética, dentre outras. Recentemente, uma ampla gama de aplicações potenciais da nanotecnologia tem sido contemplada também na agricultura, levando a pesquisas intensas em nível acadêmico e industrial. As nanopartículas (NPs) ou nanomateriais (NMs) são as maiores novidades neste campo da ciência, sendo definidos como materiais de tamanho muito reduzido (<100 nm) com propriedades singulares, frequentemente com propriedades distintas dos elementos que as constituem. Devido a sua ampla utilização, esses NMs acabam alcançando o solo, a água e o ar, levantando questões sobre os seus possíveis impactos ambientais. Esse questionamento culminou com o desenvolvimento da Nanotoxicologia, que procura não apenas investigar a toxicidade desses NMs sobre os organismos vivos, mas também uma maneira de a resolver. Até o momento, a maioria dos estudos realizados nesta área visam investigar a toxicidade das NPs sobre animais. Entretanto, nos últimos anos tornou-se crescente a preocupação sobre os impactos das NPs sobre a produtividade dos sistemas agriculturais. Dessa forma, o presente estudo objetivou investigar os efeitos de NPs de Al2O3 sobre o crescimento e metabolismo de lignina em plantas de soja. A escolha das NPs de Al2O3 deve-se ao fato de estarem entre as mais utilizadas industrialmente e por terem sido, até o momento, pouco estudadas. Atualmente, estas NPs são utilizadas em enchimentos cosméticos, ferramentas de corte, materiais de vidro, além de serem constituintes fundamentais de nanofertilizantes e nanopesticidas. Resolvemos monitorar o processo de lignificação porque, frequentemente, ele está associado com reduções de crescimento decorrentes de estresses ambientais. MATERIAIS E MÉTODOS – Para isso, sementes de soja (BMX-Potência) foram germinadas durante três dias e, em seguida, cultivadas em recipientes contendo vermiculita durante 16 dias. O tratamento das plantas foi realizado a cada dois dias pela adição de 25 mL de solução nutritiva de Hoagland contendo 50, 100, 250, 500 ou 1000 mg L-1 de NPs de Al2O3. As plantas foram mantidas, por todo o tempo de cultivo, em câmara de crescimento de plantas com temperatura de 25ºC, fotoperíodo de 12h/12h (claro/escuro) e irradiação de 300 ?mols de fótons m-2 s-1. No 16º dia de cultivo as plantas foram retiradas do sistema experimental para determinação dos parâmetros de crescimento (comprimento e biomassa fresca e seca de caules e raízes). As raízes de algumas plantas foram fixadas em tampão para posterior análises microscópicas. Raízes e caules frescos foram utilizados para determinação das atividades da fenilalanina amônia liase (PAL) e das peroxidases (POD) solúvel e ligada a parede celular. Os teores de lignina foram determinados pelo método da lignina solúvel em brometo de acetila, enquanto que os conteúdos de compostos fenólicos foram estimados pelo método de Folin-Ciocalteu. A composição monomérica da lignina foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência após a sua oxidação com nitrobenzeno. A morfologia e o tamanho das NPs de Al2O3 foi monitorada através de microscopia eletrônica de transmissão (MET). RESULTADOS E DISCUSSÃO – Quando vistas por MET as NPs de Al2O3 apresentam forma irregular e tamanho variando entre 20 e 60 nm. De modo geral, as NPs de Al2O3 reduziram o crescimento das raízes (comprimento e biomassa fresca) sem afetar significativamente o crescimento dos caules (exceto por um estreito estímulo da biomassa seca no tratamento com 500 mg L-1). Danos celulares na superfície das raízes causados pelas NPs foram visíveis por MEV. Análises espectroscópicas de raios X por dispersão em energia acopladas ao MEV revelaram que o elemento alumínio está presente em maiores proporções nos tecidos das plantas tratadas com as NPs do que em plantas controle. A atividade da PAL foi drasticamente reduzida nos caules, apresentando apenas uma tendência de redução nas raízes. Opostamente, a atividade das peroxidases (POD) solúvel e ligada a parede celular foram estimuladas em ambos os órgãos. Os teores de lignina de raízes e caules foi estimulado de forma dose-dependente pelos tratamentos com as NPs de Al2O3. Os teores de compostos fenólicos totais também aumentou em raízes e caules. Nas raízes, a composição monomérica da lignina também foi alterada, sendo esta alteração caracterizada por uma expressiva redução dos teores do monômero H nas menores doses usadas da NP. Os dados sugerem que a redução do crescimento das raízes de plantas de soja expostas às NPs de Al2O3 deve-se a um conjunto de fatores. Danos celulares nas raízes podem ter sido causados pela obstrução dos poros da parede celular com consequente interferência na absorção de água e nutrientes, bem como por estresse oxidativo. A presença de NPs com dimensões maiores do que 20 nm pode ser a causa da obstrução dos poros da parede celular. Por sua vez, o estímulo da atividade da POD solúvel, bem como os altos níveis de compostos fenólicos antioxidantes, fortalece a hipótese do estresse oxidativo. Os compostos fenólicos podem ser responsáveis pela inibição da atividade da PAL nos caules. O aumento da lignificação e a modificação da composição monomérica da lignina podem ter enrijecido a parede celular e, consequentemente, limitado a expansão celular e o crescimento

ABSTRACT: INTRODUCTION AND OBJECTIVES – Nanotechnology has been widely applied in several fields of science, especially in the medical, pharmaceutical, cosmetic, and other fields. Recently, a wide range of potential applications of nanotechnology has also been contemplated in agriculture, leading to intense research at the academic and industrial levels. Nanoparticles (NPs) or nanomaterials (NMs) are the major innovations in this field of science, being defined as materials of very small size (<100 nm) with singular properties, often with properties other than their constituent elements. Due to their wide use, these NMs reach the soil, water and air, raising questions about their possible environmental impacts. This questioning culminated with the development of Nanotoxicology, which seeks not only to investigate the toxicity of these NMs on living organisms, but also a way to solve them. To date, most of the studies conducted in this area aim to investigate the toxicity of NPs on animals. However, in recent years there has been growing concern about the impacts of NPs on the productivity of agricultural systems. Thus, the present study aimed to investigate the effects of Al2O3 NPs on the growth and metabolism of lignin in soybean plants. The choice of the NPs of Al2O3 is due to the fact that they are among the most used industrially and because they have so far been little studied. Currently, these NPs are used in cosmetic fillers, cutting tools, glass materials, as well as being fundamental constituents of nanofertilizers and nanopesticides. In addition, we have decided to monitor the lignification process because it is often associated with reductions in growth due to environmental stresses. MATERIALS AND METHODS – For this, soybean seeds, cv. BMX-Potência, were germinated for three days and then grown in vermiculite for 16 days. The treatment of plants was performed every other day by the addition of 25 mL of Hoagland nutrient solution containing 50, 100, 250, 500 or 1000 mg L-1 of Al2O3 NPs. The plants were grown in a plant growth chamber with a temperature of 25ºC, 12h/12h photoperiod (light/dark) and irradiation of 300 ?mols of photons m-2 s-1. On the 16th day of cultivation the plants were removed from the experimental system to determine growth parameters (length and fresh and dry biomass of stems and roots). The roots of some plants were fixed in buffer for further microscopic analysis. Fresh roots and stems were used to determine the activities of phenylalanine ammonia lyase (PAL) and soluble and cell wall bound peroxidases (POD). The lignin contents were determined by the lignin method soluble in acetyl bromide, while the contents of phenolic compounds were estimated by the Folin-Ciocalteu method. The lignin monomer composition was determined by high performance liquid chromatography after oxidation with nitrobenzene. The morphology and size of the Al2O3 NPs were monitored by transmission electron microscopy (TEM). RESULTS AND DISCUSSION - When viewed by MET the NPs of Al2O3 presents irregular shape and size ranging from 20 to 60 nm. In general, Al2O3 NPs reduced root growth (length and fresh weight) without significantly affecting stem growth (except for a slight stimulus of dry weight in treatment with 500 mg L-1). Cell damage at the roots surface caused by NPs was visible by SEM. Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) analysis coupled to SEM revealed that the aluminum element is present in larger proportions in the tissues of plants treated with NPs than in control plants. The activity of the PAL was drastically reduced in the stems, presenting only a tendency of reduction in the roots. However, the activities of soluble and cell wall bound PODs were stimulated in both organs. The lignin contents of roots and stems were dose-dependently stimulated by treatments with Al2O3 NPs. The contents of total phenolic compounds also increased in roots and stems. In the roots, the lignin monomer composition was also altered, being this alteration characterized by an expressive reduction of the levels of monomer H in the lower doses used of the NP. The data suggest that the reduction of the root growth of soybean plants exposed to Al2O3 NPs is due to a set of factors. Cell damage in the roots may have been caused by cell wall pore obstruction with consequent interference in water and nutrient uptake as well as oxidative stress. The presence of NPs with dimensions larger than 20 nm may be the cause of cell wall pore obstruction. In turn, the stimulation of soluble POD activity, as well as the high levels of antioxidant phenolic compounds, strengthens the hypothesis of oxidative stress. Phenolic compounds may be responsible for the inhibition of PAL activity in the stems. Increased lignification and modification of lignin monomer composition may have stiffened the cell wall and, consequently, limited the cell expansion and growth