Produção de ciclodextrinas : desde a purificação e caracterização cinética da CGTase á imobilização de células de bacilos alcalofílicos e cristalização da beta-ciclodextrina

Abstract

RESUMO: Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é a única enzima capaz de converter amido em ciclodextrinas (CDs), que são maltooligossacarídeos cíclicos constituídos por um número variável de unidades de glucose. A CGTase de Bacillus sphaericus cepa 41 foi purificada 315 vezes por cromatografia de afinidade bioespecífica. O peso molecular foi estimado em 59 kDa. O pH ótimo foi 6,0 e a temperatura ótima foi 65ºC. A enzima mostrou estabilidade frente ao pH entre 6,0-7,0. A desativação térmica foi evidente acima de 70ºC e a enzima foi altamente estável abaixo de 65ºC. As energias de ativação e desativação para produção de - CD foram calculadas. A influência da concentração do substrato na produção inicial de -CD foi estudada e os parâmetros cinéticos foram determinados. A CGTase produziu 22 g/L de CDs, numa razão de 0,40:1:0,45 de -, - e -CD e foi fortemente inibida pelos produtos. A biossíntese de CGTase e -CD por células de Bacillus firmus cepa 37 e Bacillus sphaericus cepa 41 imobilizadas em esponja vegetal foi otimizada. As células imobilizadas oferecem várias vantagens, como o uso repetido e prolongado dessas células, a facilidade de separação do meio de fermentação e reduzido risco de contaminação. Ambos os micro-organismos produziram níveis significantes de CGTase por 3 ciclos consecutivos (94,2 U/mL em média), e aumentaram a formação relativa de -CD com inibição da formação das outras CDs. A cristalização da -CD produzida pelas bactérias imobilizadas resultou em 64% de recuperação e 89,5% de pureza. As técnicas de Tilden-Hudson e FTIR-ATR auxiliaram na investigação da produção de CDs e imobilização celular

ABSTRACT: Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is a unique enzyme capable of converting starch into cyclodextrins (CDs). CDs are cyclic oligosaccharides consisting of a varying number of glucose units. The CGTase from Bacillus sphaericus strain 41 was purified up to 315-fold by biospecific affinity column chromatography. The molecular weight was estimated to be 59 kDa. The optimal pH was 6.0 and the temperature was 65ºC. The enzyme showed pH stability in the range of 6.0-7.0. Thermal deactivation was noticeable above 70ºC, and the enzyme was highly stable below 65ºC. The activation and deactivation energy for the production of -CD were calculated. The influence of substrate concentration on the initial rate of CD production was studied, and the kinetic parameters were determined. The CGTase produced 22 g/L of CDs, in the ratio of 0.40:1:0.45 of -, - and -CD and was strongly inhibited by the products. The biosynthesis of CGTase and ?-CD was optimised by immobilisation of Bacillus firmus strain 37 and Bacillus sphaericus strain 41 cells on a loofa sponge. Immobilised cells offer several advantages, such as the prolonged and repeated use of the cells, ease of separation from the fermentation medium and a reduced risk of contamination. Both microorganisms produced significant levels of CGTase for 3 consecutive cycles (94.2 U/mL on average), increased the relative formation of the ?-CD and inhibited the formation of other CDs. The crystallisation of the CD produced by both bacterial strains resulted in a 64% recovery of ?- CD and 89.5% purity. The Tilden-Hudson and FTIR-ATR techniques assisted in the investigation of the production of cyclodextrins and the cell immobilisation